Рекомбинантный полипептид со свойствами антагониста рецептора IL-1, выделенная ДНК, экспрессирующий вектор pSF5, линия клеток COS, способ получения полипептида, фармацевтическая композиция

Номер патента: 13277

Опубликовано: 15.07.2003

Авторы: МУЦИО Марта, МАНТОВАНИ Альберто, КОЛОТТА Франческо

Есть еще 10 страниц.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

Описан новый антагонист интерлейкина-1,активный как в отношении IL-la, так и IL-1B, новаяднк-последовательность, кодирующая антагонистIL-1, и способ получения антагониста IL-1 методикойрекомбинантных ДНК, описано такжепрофилактическое, терапевтическое идиагностическое приме­нение такого новогоантагониста IL-1 при патологиях, зависящих отпродуцирования IL-1.

Текст

Смотреть все

(51)7 12 15/24, 12 15/25, 12 15/12, 12 15/85, 12 5/10, 07 14/54, 61 38/20 ПАТЕНТНОЕ ВЕДОМСТВО РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(73) АППЛАЙД РЕЗЧ СИСТЕМЗ АРС ХОЛДИНГ Н.В. 3. ., . . . . ,. 85, 1988, . 2929-2933. 4. ЩЕЛКУНОВ С.Н. Конструирование гибридных молекул ДНК. Новосибирск Наука, 1987, с. 164(54) РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПОЛИПЕПТИД СО СВОЙСТВАМИ АНТАГОНИСТА РЕЦЕПТОРА(57) Описан новый антагонист интерлейкина-1, активный как в отношении -, так и -1, новая днк-последовательность, кодирующая антагонист 1, и способ получения антагониста -1 методикой рекомбинантных ДНК, описано также профилактическое, терапевтическое и диагностическое применение такого нового антагониста -1 при патологиях, зависящих от продуцирования -1. 13277 ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Оно описывает новый антагонист интерлейкина-1 (-1) активный в отношении как -,так и -1 В, новую последовательность , кодирующую антагонист -1, и способ получения антагониста -1 методикой рекомбинантной . Оно также описывает профилактическое, терапевтическое и диагностическое применение такого нового антагониста -1 при патологиях, зависящих от образования -1. ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ Существуют два различных гена, кодирующих интерлейкин-1 (-1), названные -1 а и -1 В, которые кодируют белок -1 а и -1 В, соответственно. Интерлейкины -1 а и -1 В являются плейотропными цитокинами, которые, хотя их последовательности и обнаруживают недостаточную аналогию, оказывают множество сходных воздействий на различные ткани и влияют на многие патологии человека, в частности на иммунный ответ организма и на воспалительные процессы. Оба белка имеют молекулярную массу около 17,5 кД, и они предварительно синтезируются как молекула предшественника большего размера,имеющая молекулярную массу около 31 кД.-1 ы являются сильными воспалительными и пирогенными цитокинами, которые обычно имеют полезные эффекты, но могут также иметь эффекты,вредные для здоровья организма. Они могут, например, принимать участие в патогенезе симптомов аутоиммунных патологий, подобных красной волчанке, в частности, они участвуют как медиаторы в провоцировании поражения тканей,как, например, при ревматоидном артрите. Многие биологические эффекты -1 подобны тем, которые могут наблюдаться в случае сепсиса. Последние исследования продемонстрировали, что внутривенное введение -1 в дозах от 1 до 10 нг/кг вызывает лихорадочное состояние, сонливость, отсутствие аппетита, общую миалгию, артралгию и сильную головную боль. Так как -1 имеет плейотропные биологические свойства, многие из которых отрицательно воздействуют на организм, мощные эффекты -1 должны находиться под четким физиологическим контролем. Синтез -1 ингибируется противовоспалительными цитокинами, простагландинами и глюкокортикоидами, и наличие множества уровней ингибирования -1 указывает на необходимость точного регулирования этого медиатора.-1 является единственным цитокином, для рецептора которого до настоящего момента описан антагонист-полипептид, третьим известным на сегодня компонентом семейства -1 является антагонист рецептора -1 (-1 а). Все три компонента (-1 а, -1 В и -) распознаются и связываются с одним и тем же рецепто 2 ром на поверхности клетки (-1) связывание-1 а и -1 В с -1 передает сигнал,-1 - нет. Существует два типа рецепторов -1, названные-1 и -1. -1 является полипептидом, который связывает -1 и обладает меньшим сродством к -1 без какой-либо агонистической активности. Образование -1 г вызывается , цитокинами и бактериальными продуктами в различных клеточных типах, включая мононуклеарные фагоциты,полиморфонуклеарные клетки (ПМН) и фибробласты. До сих пор идентифицированы и клонированы две молекулярные формы -1 1) секретированный -1 (-1) содержит классическую лидерную последовательность из 25 аминокислот, дающую зрелый белок из 152 аминокислот 2) внутриклеточный -1 (-1) испытывает недостаток в лидерной последовательности, а это предопределяет то, что белок остается внутриклеточным.- и -1 образуются из одного и того же гена. Транскрипты -1 берут начало от сайта альтернативной инициации и от сплайсинга первого альтернативного экзона во внутреннем акцепторном участке сплайсинга, размещенном в первом экзоне-1. Прогнозируемые белки, таким образом,идентичны за исключением их Н 2-концов, где первые 21 аминокислота -1 замещены четырьмя аминокислотами в -1. Экспрессия транскриптов, кодирующих -1 и-1, регулируется по-разному. Биологическая значимость -1 еще не выяснена. Подразумевается, что -1 принимает участие в патогенезе многих болезней, поэтому очевидна необходимость иметь доступные медикаменты, пригодные для ограничения вредных для здоровья эффектов -1. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Цель настоящего изобретения - обеспечить антагонист -1 активный в отношении как -1, так и-1 и их комбинации. Следующая цель настоящего изобретения - обеспечитьпоследовательность, кодирующую антагонист -1, и способ получения такого нового антагониста методикой рекомбинантной . Другая цель настоящего изобретения - обеспечить антагонист в практически очищенной форме,чтобы он был пригоден для применения в фармацевтических композициях, действенных против патологий, которые требуют ингибирования -1. Дальнейшие цели и преимущества изобретения станут очевидными в следующем описании. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР И СПИСКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ Фиг. 1 описывает последовательностьи последовательность белка для части вне общей, 1 (О 8 иО 9) в сравнении с тем же для -1 (-О 6) и -1 13277 для общей части -1 (13 и 14). Фиг. 2 описывает - анализ экспрессии- в различных типах клеток. Фиг. 3 описывает вестерн-блоттинг рекомбинантного -. Фиг. 4 описывает влияния - на индуцированную -1 экспрессию Е-селектина в эндотелиальных клетках.О 1 представляет последовательность олигонуклеотида, названного А 5, для применения в -.2 представляет последовательность олигонуклеотида, соответствующую нуклеотидам 69-70 В-актина , для применения в -.3 представляет последовательность обратного олигонуклеотида, комплементарного нуклеотидам 430-449, для применения в -.4 представляетпоследовательность, кодирующую -1 а, для части вне общей.5 представляет аминокислотную последовательность -1 для части вне общей.6 представляетпоследовательность, кодирующую три аминокислоты -1, для части вне общей.7 представляет три аминокислоты-1 для части вне общей.8 представляетпоследовательность, кодирующую -1, для части вне общей.9 представляет аминокислотную последовательность -1 для части вне общей.10 представляетпоследовательность -1 для части вне общей. Что касается вопросов, относящихся к программеЕРО,для получения последовательностейнуклеотид присоединяют в первом положении последовательности для того, чтобы обеспечить кодирование первой аминокислоты , и с тем, чтобы избежать образования терминирующего кодона на внутренней стороне последовательности.11 представляет аминокислотную последовательность -1 для общей части.12 представляет последовательность из 21 аминокислоты, которая представляет фрагмент-1, не общий с другими -1.13 представляетпоследовательность, кодирующую полный -1.14 представляет аминокислотную последовательность полного -1. ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Этот новый антагонист -1 получен путем инсерции в рамку , кодирующей -1. новой последовательности из 63 пар оснований (р) между первым - специфичным экзоном и внутренним акцепторным участком первого экзона -1. Путем - экспериментов авторы этого изобретения обнаружили, что этот новый транскрипт экспрессируется в активированных моноцитах и фибробластах и в полиморфонуклеарных клетках Экспрессия в клеткахпоказала, что этот новый антагонист является в наибольшей степени внутриклеточным и имеет молекулярную массу приблизительно 25 кД по -. Новый рекомбинантный антагонист обнаруживает способность ингибировать -1. В настоящей заявке, для ясности и простоты, известный в настоящее время -1 обозначен как-1 типа(-1), в то время как новый антагонист, описанный здесь и являющийся предметом настоящего изобретения, определен как -1 типа(-1). Примерами патологий, при которых новый антагонист в соответствии с настоящим изобретением может быть с успехом использован для профилактики, терапии или диагностики, являются ревматоидный артрит, септический шок, острый миеломоноцитарный лейкоз, иммунологическая реакция трансплантат против хозяина, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), язвенный колит и все аутоиммунные заболевания вообще. Воплощением изобретения является введение фармакологически активного количества -1 людям, имеющим высокий риск развития патологий,требующих ингибирования -1, или людям, у которых уже проявляются патологии, подобные сепсису. Примером вышеуказанной категории являются пациенты, ожидающие хирургической операции. Любой путь введения, совместимый с действующим началом, может быть использован, но особенно предпочтительным является парентеральное введение, так как позволяет получить за короткое время системные эффекты. По этой причине предпочтительно введение внутривенного болюса непосредственно до, во время или после хирургической операции. Дозу 1, которая должна быть введена, подбирают на основе медицинских показаний в соответствии с возрастом, массой и индивидуальной реакцией пациента. Дозировка может быть между 0,05 и 30 мг/кг массы тела, а предпочтительная дозировка - между 0,1 и 10 мг/кг массы тела. Фармацевтическая композиция для парентерального применения может быть приготовлена в форме для вливания, содержащей действующее начало и подходящий носитель. Носители для парентерального введения хорошо известны на практике и содержат, например, воду, солевой раствор, раствор Рингера и декстрозу. Носитель может содержать меньшие количества наполнителей для того, чтобы обеспечить стабильность и изотоничность раствора. Приготовление указанных растворов может быть осуществлено в соответствии с обычными приемами, а предпочтительное содержание -1 должно быть между 1 мг/мл и 10 мг/мл. Кроме того, примерами патологий, при которых новый антагонист в соответствии с настоящим изобретением может быть с успехом применен в целях 3 13277 профилактики, терапии и диагностики, являются ревматоидный артрит, септический шок, острый миеломоноцитарный лейкоз, иммунологическая реакция трансплантат против хозяина, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), язвенный колит и все аутоиммунные заболевания вообще. Настоящее изобретение описано со ссылкой на специфические его воплощения, но содержание описания охватывает все модификации и замещения,которые могут быть произведены специалистом в этой области, не выходя за рамки содержания и целей пунктов формулы изобретения. В следующей части будут описаны некоторые способы осуществления изобретения, хотя могут быть использованы и эквивалентные материалы и способы. Поэтому следующие примеры являются чисто иллюстративными и не ограничивающими изобретения. ПРИМЕР 1 Клонирование и характеризация -1 МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ Реагенты Для культивирования и отделения клеток используют следующие коммерчески доступные реагенты апирогенный солевой раствор и дистиллированную воду для клинического применения среду 1640 средусреду 199 -глутамин, - взятую в асептических условиях сыворотку телячьих эмбрионов ростовую добавку эндотелиальных клеток , полученную из бычьего мозга гепарин. Все реагенты содержат менее 0,125 /мл эндотоксина, что проверено способом анализа с использованием лизата амебоцитов . Клетки ПМН и моноциты человека, циркулирующие в кровеносной системе, выделяют из периферической крови здоровых доноров центрифугированием в ступенчатом (46 для моноцитов и 62 для ПМН) градиенте изоосмотического (285 ), как описано.,.,., .,. . . 132936, 1984. Клетки выделяют на границе раздела,дважды промывают в солевом растворе и ресуспендируют в среде. Процент выделяемых ПМН и моноцитов превышает 90 , а чистота - 98 , что определяют морфологическим изучением окрашенных центрифугированных в цитоцентрифуге клеток. Для ПМН и моноцитов обычно применяют среду для культивирования клеток 1640 с 2 мМ -глутамина и 10. Эндотелиальные клетки человека (ЕС) получают из пупочных вен и культивируют, как подробно описано в литературе ( .,С.,.,.,.,.,Обычно применяют конфлюэнтные клетки 2-го 5-го пассажей, поддерживаемые в среде 99 с 10 с добавлением(50 мкг/мл) и гепарина(100 мкг/мл). Клеткикультивируют в средес 10, а клетки фибробластов 8387 - в среде 1640 с 10. После соответствующей обработки клетки исследуют на-1 или белок -1, как описано ниже. Тотальнуюэкстрагируют способом с использованием изотиоцианата гуанидина с незначительными модификациями.,. 26718278, 1992. Коротко говоря, проводят обратную транкрипцию 1 мкг тотальнойв обратно транскриптазном буфере (5 мМ 2, 50 мМ КС, 10 мМ трис рН 8,3) с 2,5 мМ случайных гексамеров, 1 мМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1 ед/мл ингибитора зы и 2,5 ед/мл транскриптазы вируса лейкоза мышей( ). Образцы инкубируют в течение 10 мин. при 25 С, а затем в течение 45 мин. при 42 С. Потом в реакциюдобавляют специфичную пару праймеров, разработанных для амплификации ,кодирующих -1 или -1, а также Вактин человека в качестве внутреннего контроля. Амплификацию проводят в 2 мМ 2, 50 мМ КС, 0,2 каждого дезоксинуклеотидтрифосфата,2,5 единицы/100 мл полимеразы((см. ниже). Амплификацию (30 циклов) ведут в автоматизированном термальном циклере при 95 С, при 55 С и при 75 С по 1,5 мин для каждого условия. Амплифицированные продукты проводят через агарозный гель, окрашенный 1 бромидом этидия вместе с стандартами молекулярной массы( , , ). Олигонуклеотиды синтезируют фосфороамидитным способом. Последовательности нуклеотидов,применяемые для селективной амплификации 1, идентичны описанным..,., , 883681, 1991. В частности, авторы используют олигонуклеотиды 397 (описаны здесь как 1) и 368 ( 4). Для амплификации -1 авторы используют 4 и 5 (1), которые специфично распознают дополнительный экзон, который, как описано здесь, входит в последовательность 1. Для амплификации В-актина описан прямой олигонуклеотид в 2, соответствующий нуклеотидам 60-79 В-актина. 13277 Обратный олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 430-449, представлен 3. Продукты амплификации субклонируют (ТА, ,, ) и секвенируют способом терминации дидезоксицепи. Экспрессия продуктов -1 в клетках, содержащие 32 пары оснований 5 нетранслируемого участка, полную открытую рамку считывания и 6 пар оснований (включающих стопкодон) 3-нетранслируемого участка как -1,так и -1, получают - с олигонуклеотидами 4 и 5, как подробно описано выше, и затем лигируют в экспрессирующий вектор 5. Достоверность обратной транскрипции и амплификации проверяют секвенированием. Плазмиды, содержащиев корректной ориентации, очищают в градиенте , а затем трансфицируют ими клеткиспособом осаждения кальция, как описано..,, 1989. Через два дня супернатанты культуры и лизаты обработанных ультразвуком клеток исследуютили иммуноблоттингом, как подробно описано ниже. Пустую (нетрансфицированную) плазмиду используют в качестве контроля. Идентификация иммунореактивного -1 Используют коммерческий тест(, , ), который идентифицирует как -1, так и -1. Для вестернблоттинга (анализа) используют поликлональные антисыворотки двух кроликов и одной козы. Образцы лизатов и супернатанты клетокподвергают электрофорезу 12,5-, а затем блоттингу на нитроцеллюлозном фильтре(,, , ). Инкубацию с первичными и вторичными антителами осуществляют согласно стандартным методикам. Первичные антитела представлены поликлональными антителами кролика против -1. Вторичные антитела представлены фракцией козьего иммуноглобулина против кролика, связанной с пероксидазой хрена . Бэнды фракции иммунореактивного белка обнаруживают способом на основе хемилюминесценции ( ,), осуществляемым согласно рекомендациям производителя. Индуцируемая -1 экспрессия Е-селектина на ЕС Конфлюэнтные ЕС, культивированные в 96 луночных планшетах , инкубируют в течение 30 минут с количеством лизата трансфицированных клеток(см. выше), которое соответствует 25 до 100 нг рекомбинантного -1 (-1 или -1), что определяют специфическим анализом. В качестве контроля параллельно используют равное количество лизата , полученного из обманно трансфицированных клеток. Затем ЕС обра батывают в течение 6 часов 0,1-1 нг/мл рекомбинантного -1 человека. Детекцию экспрессии Еселектина осуществляют анализомна адгезионных ЕС с моноклональным антителом 1-2 против Е-селектина в качестве первичного антитела и антисывороткой кроликов против мышиного ,конъюгированной с пероксидазой хрена, в качестве вторичного антитела. (оптическую плотность) образцов определяют детекцией планшетов на спектрофотометрепри длине волны 405. РЕЗУЛЬТАТЫ Идентификация -1 Специфические олигонуклеотидные праймеры разрабатывают (указаны как 1 и 4 на фиг. 1) для получения полной кодирующей последовательности -1 (фиг. 1) с помощью -. Амплифицированные продукты из ПМН человека субклонируют и секвенируют. Дополнительно к ранее известной последовательности -1 изобретатель выделяет ряд клонов, последовательности которых идентичны опубликованной кодирующей последовательности 1 при важном исключении, которое составляет дополнительная последовательность из 63 пар оснований между нуклеотидами 132 и 133 последовательности -1. С помощью описанных экзонинтронных связей -1 дополнительную последовательность вводят между первым безлидерным экзоном -1 и внутренним акцепторным сайтом первого экзона -1 (фиг. 1). На фиг. 1 представлена рассчитанная аминокислотная последовательность. Новый белок (далее называемый -1 типа ) имеет первые три аминокислоты на Н 2-конце как у классического -1(-1 типа ), за которыми следует новая последовательность из 21 аминокислоты. Остальные части у двух белков идентичны. Любопытно, что связывание с внутренним акцепторным сайтом первого экзона -1 всегда дает как у -1, так и у -1 и -1 остаток одной и той же аминокислоты, например глутаминовой кислоты (фиг. 1). Наиболее удивительной характеристикой вставленной аминокислотной дополнительной последовательности является наличие семи остатков глицина,шесть из которых являются последовательными. Остатки глицина фланкированы с обеих сторон остатками глутаминовой кислоты. -1 состоит из 180 аминокислот. В целом гидрофильный образец -1 близок к таковому -1, но не имеет гидрофобного лидерного пептида на Н 2-конце. Экспрессия -га Для идентификации транскриптов -1 проводят анализ - с парой специфически созданных олигонуклеотидов ( 5 и 4, фиг. 1) с ожидаемым амплифицированным продуктом из 33 пар оснований. Как показано на фиг. 2, транскрипты, кодирующие -1, определяют в РМА-, -1- и 5 13277 активированных фибробластах. Слабый, но поддающийся определению бэнд отмечен в моноцитах,обработанных . ПМН, как обработанные, так и необработанные,(фиг. 2) также имеют очень слабый бэнд ожидаемого размера. Специфичность амплифицированных продуктов,показанная на фиг. 2, подтверждают субклонированием и секвенированием. Экспрессия рекомбинантного -1 Клеткитрансфицируют последовательностью , кодирующей -1, и, для сравнения,последовательностью, кодирующей -1. Затем клеточные лизаты и супернатанты исследуют вестрен-блоттингом. Поликлональные антисыворотки, используемые в этих экспериментах, одинаково хорошо распознают-1 и -1 (фиг. 3). Большинство, если не все, -1 и -1 обнаруживают в клеточных лизатах. Рекомбинантный -1 мигрирует как предоминантный бэнд 22 кД, тогда как -1 имеет массу приблизительно 25 кД. Ингибирование активности -1 рекомбинантным Рекомбинантный -1 исследуют на активность ингибирования -1. Для этой цели авторы выбирают индуцированную -1 экспрессию Еселектина на эндотелиальных клетках, поскольку этот анализ является чувствительным (определяемая индукция 100 пг/мл -1 или менее) и быстрым (6 часов инкубации с -1). Лизаты обманно трансфицированных клетокне приводят к значительному снижению активности -1.-1 не обладает агонистической активностью. Как показано на фиг. 4, рекомбинантный 1 ингибирует дозазависимым образом активность -1. Эти данные доказывают, что -1 действительно является ингибитором -1. Примеры 1. Очистка белка Очистка белка по изобретению осуществляется любым из методов, известных для этой цели, то есть при помощи любой общепринятой процедуры,включающей экстракцию, осаждение, хроматографию, электрофорез, или подобные методы. Дальнейшая процедура очистки, которая может использоваться для предпочтительной очистки белка по изобретению - афинная хроматография с использованием моноклональных антител, которые связывают целевой белок и которые получены и иммобилизованы на гелевой матрице, находящейся в колонке. Неочищенные препараты, содержащие рекомбинантный белок, пропускают через колонку. Белок будет связываться в колонке специфическим антителом, в то время как примеси будут проходить через колонку. После промывки белок элюируется из геля за счет изменения рН или ионной силы. 2. Фармацевтические композиции Лекарственное средство предпочтительно представлено в форме фармацевтической композиции,включающей белок по изобретению вместе с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями и/или наполнителями. Такие фармацевтические композиции формируют так же, как дальнейший аспект настоящего изобретения. Белок изобретения должен вводиться в эффективном количестве. Эффективное количество относится к количеству активных ингредиентов, которые оказывают достаточное действие для курса лечения при тяжести заболеваний, описанных выше, приводя к снижению тяжести или ремиссии такой патологии. Эффективное количество будет зависеть от пути введения и состояния пациента.Фармацевтически приемлемый понимается как охватывающий любой носитель, который не влияет на эффективность биологического действия активного ингредиента и который не является токсичным по отношению к объекту, которому он вводится. Например, для парентерального введения вышеупомянутые активные ингредиенты могут быть приготовлены в виде единичной дозировочной формы для инъекции в таких носителях, как солевой раствор,растворы декстрозы, сывороточного альбумина и раствор Рингера. Помимо фармацевтически приемлемого носителя, композиции по изобретению могут также включать незначительные количества добавок, таких как стабилизаторы, наполнители, буферы и консерванты. Введение такой фармацевтической композиции может быть внутривенным, внутримышечным или подкожным. Другие пути введения, которые могут обеспечить желательные уровни соответствующих ингредиентов в крови, также входят в объем притязаний настоящего изобретения. Дозировка вводимого терапевтического соединения определяется в соответствии с клинической практикой и будет варьироваться в зависимости от таких факторов, как возраст пациента, рост, вес,пол, предыдущего лечения и общемедицинского состояние. Обычно желательно вводить пациенту начальную дозу от приблизительно 50 мкг/кг веса до приблизительно 30 мг/кг веса пациента ежедневно или несколько (например 3) раз в неделю, хотя может вводиться и более низкая или более высокая доза. В частности, доза определяется фармакокинетикой клиренса вводимого белка с использованием стандартных фармакокинетиких правил, известных в данной области. Способы изготовления таких дозировок известны или являются очевидными для специалистов, см., например, . , , .,, 18. (1990), то есть концентрация активного вещества настоящего изобретения в терапевтических составах не критична, хотя обычно варьирует от 13277 приблизительно 1 мкг/мл до приблизительно 20 мг/мл. ОБСУЖДЕНИЕ Изобретатели описывают новую молекулярную форму -1. Новую молекулу получают инсерцией 63 пар оснований между первым безлидерным экзоном -1 и внутренним акцепторным саитом первого экзона -1. Поскольку полученный белок частично идентичен классическому -1, за исключением дополнительной последовательности из 21 аминокислоты,расположенной на Н 2-конце молекулы, изобретатели предполагают назвать эту новую форму 1 типа , считая классическую последовательность-1 как -1 типа . Эксперименты с использованием - показывают, что транскрипты -1 индуцируются в моноцитах и фибробластах. Рекомбинантный 1, экспрессирующийся в клетках , имеет среднюю мол. массу приблизительно 25 кД и активность ингибирования -1, сравнимую с активностью, проявляемой -1 при экспрессии в тех же экспериментальных условиях. Транскрипты, кодирующие -1 и -1,получают с одного и того же гена, используя различный сплайсинг. -1 получают с помощью альтернативного начала транскрипции экзона, введенного во внутренний акцепторный сайт первого экзона, содержащего лидерную последовательность-1. Результаты, полученные изобретателями, предполагают новую организацию гена -1, при которой дополнительный экзон расположен между первым экзоном классического -1 и -1, соответственно. При использовании этого нового экзона получают полипептидную молекулу, которая при отсутствии сигнального пептида отличается по концу от -1 инсерцией 21 аминокислоты, сохраняя при этом способность ингибировать -1. Использование альтернативного сплайсинга для создания различных молекул -1 представляется регулируемым в высокой степени. Транскрипты-1 индуцируют с помощью -1,и форболовых эфиров в фибробластах и с помощьюв моноцитах. Обнаружено, что в фибробластах форболовые эфиры селективно индуцируют транскрипты -1, тогда как -1 ииндуцируюткак -1, так и -1. В моноцитах 13, увеличивающий транскрипцию как -1, так и-1, не индуцирует -1. Наконец, ПМН, в которых -1 и -1 конститутивно экспрессируются и индуцируются, экспрессируют очень мало транскриптов, как установлено -. Более того, эти данные показывают, что механизмы, индуцирующие с помощью различного сплайсинга образование трех форм -1,регулируются различным образом в ответ на внешние сигналы. Аминокислотная последовательность описанной здесь дополнительной последовательности удиви тельна тем, что она содержит семь остатков глицина, шесть из которых расположены последовательно. Богатые глицином последовательности присутствуют в молекулах с различными биологическими активностями, включая предсердный рецептор натрийуретического клиренса, гомеобокс гена НОХ 11,промежуточные нити кератинов и ядерные белки,участвующие в связывании цетромера или сплайсинге . Однако, за исключением остатков глицина, очевидная гомология аминокислотных последовательностей, фланкирующих богатые глицином участки,не обнаружена между этими белками и -1. Система -1 демонстрирует необычайный уровень сложности, представленный двумя агонистами,двумя рецепторами, один из которых является ингибитором -1, и антагонистом рецептора, для которого могут существовать, по меньшей мере, три различные молекулярные формы, если принять во внимание полученные результаты. Хотя биологическое значение внутриклеточных форм -1 а требует четкого установления, приведенные здесь данные указывают, что альтернативным сплайсингом можно получить две различные формы -1 с различными -концами в ответ на выбранные внешние стимулы. Наличие множественных и сложных уровней контроля -1 указывает на абсолютное требование жесткого физиологического контроля воспалительного потенциала этого цитокина. ОПИСАНИЕ ФИГУР Фигура 1 Последовательностьи рассчитанная последовательность белка -1 в сравнении с классическим -1 (-) и -1 В верхней части фиг. 1 показаны последовательностии белка, специфично представленные в-1, -1 и -1. В нижней части фиг. 1 показана последовательность, общая для трех форм-1 а. Полные последовательности каждой молекулы таким образом получают связыванием каждой специфичной части с общей последовательностью. Для ясности, последовательность-1 начинается с нуклеотида 91 опубликованной 5 нетранслируемой последовательности, и описаны только 6 пар оснований 3-нетранслируемой последовательности. Общая последовательность -1 начинается с внутреннего акцепторного сайта, расположенного в первом экзоне -1, соответствующем нуклеотиду 133 полной последовательности -1 и нуклеотиду 88 полной последовательности -1. Стрелки указывают прямой ( 1 и 5) и обратный ( 4) олигонуклеотиды, используемые для анализа -, как описано в тексте. Олигонуклеотид 5 распознает только-1. Фигура 2 Анализ - экспрессии -1 в клетках различных типов 7 13277 Проводят обратную транскрипциюфибробластов 8387 (панель А), моноцитов (В) и ПМН(С). Продукты каждой реакции синтезазатем разделяют на два образца, один из которых амплифицируют с олигонуклеотидами 5 (прямой) и 4 (обратный) с целью детекции транскриптов-1, а другой амплифицируют с В-актинспецифичными олигонуклеотидами (см. Раздел Материалы и Способы). Затем амплифицированные продукты исследуют в агарозном геле, окрашенном бромидом этидия. Амплифицированные продукты, соответствующие В-актину, приведены слева от стандарта, а амплифицированные продукты, соответствующие 1 (справа), указаны стрелкой. Специфичность этих бэндов подтверждают субклонированием и секвенированием. Фигура 3 Вестрен-блоттинг рекомбинантного -1 Клеточные лизаты из клеток , трансфицированных , которые кодируют -1 (2) или-1 (3) или пустым вектором, который не содержит такой(1), исследуют иммуноблоттингом с поликлональными антителами кролика против -1. Стандарты молекулярной массы указаны. Фигура 4 Эффекты -1 на индуцированную -1 экспрессию Е-селектина на эндотелиальных клетках Эндотелиальные клетки обрабатывают 0,1 или 1 нг/мл -1 человека с или без 25-100 нг/мл 1 или эквивалентными количествами лизатов клеток , полученных из клеток, которые обманно трансфицированы с помощью пустого вектора, как подробно описано в разделе Материалы и Способы. Через б часов инкубации эндотелиальные клетки исследуют на экспрессию Е-селектина тестом, который проводят на адгезионных клетках. Приведенные данные являются процентами индуцированной -1 экспрессии Е-селектина относительно контроля. ЗАГОЛОВОК ИЗОБРЕТЕНИЯ АНТАГОНИСТ ИНТЕРЛЕЙКИНА-1 ТИП НОСИТЕЛЯ Флоппи диск (дискета) КОЛИЧЕСТВО НИТЕЙ МОЛЕКУЛЫ одна КОЛИЧЕСТВО НИТЕЙ МОЛЕКУЛЫ одна 8 КОЛИЧЕСТВО НИТЕЙ МОЛЕКУЛЫ одна КОЛИЧЕСТВО НИТЕЙ МОЛЕКУЛЫ одна КОЛИЧЕСТВО НИТЕЙ МОЛЕКУЛЫ одна КОЛИЧЕСТВО НИТЕЙ МОЛЕКУЛЫ одна КОЛИЧЕСТВО НИТЕЙ МОЛЕКУЛЫ одна(В) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ /заметка Общая - пол.был присоединен в первом положении по причине программного обеспечения, так что первый кодон кодируети так что возникновение терминирующего кодона во внутреннем регионе посл. исключается КОЛИЧЕСТВО НИТЕЙ МОЛЕКУЛЫ одна 13277100 105 110 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Рекомбинантный полипептид со свойствами антагониста рецептора -1, характеризующийся выведенной аминокислотной последовательностью,представленной в 14, молекулярной массой, определяемой вПАА геле, около 25 и ингибирующей активностью, сопоставимой с активностью внутриклеточной формы антагониста рецептора интерлейкина-1 (-1 а). 2. Выделенная ДНК, кодирующая полипептид по п. 1 и имеющая последовательность, представленную в 13. 3. Экспрессирующий вектор 5, содержащий ДНК по п. 2, кодирующую полипептид по п. 1. 4. Линия клеток , трансформированная вектором по п. 3 - продуцент полипептида, охарактеризованного в п. 1. 5. Способ получения полипептида, охарактеризованного в п. 1, методом рекомбинантных ДНК, отличающийся тем, что указанный способ включает культивирование клеток , трансформированных вектором по п. 3, с последующим сбором и выделением кодируемого полипептида. 6. Фармацевтическая композиция, применяемая при патологиях, при которых требуется ингибирование -1, выбранных из группы, включающей аутоиммунные заболевания, септический шок, отторжение трансплантата и СПИД, содержащая терапевтически эффективное количество полипептида, охарактеризованного в п. 1, и фармацевтически приемлемый носитель. 7. Композиция по п. 6, отличающаяся тем, что патология выбрана из группы аутоиммунных патологий. 8. Композиция по п. 7, отличающаяся тем, что патология выбрана из группы, состоящей из ревматоидного артрита, септического шока, острого миеломоноцитарного лейкоза, иммунной реакции трансплантат против хозяина, синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) и язвенного колита.

МПК / Метки

МПК: C12N 5/10, C07K 14/54, A61K 38/20, C12N 15/25, C12N 15/12, C12N 15/85, C12N 15/24

Метки: полипептид, полипептида, вектор, клеток, композиция, днк, il-1, получения, фармацевтическая, способ, свойствами, линия, psf5, рецептора, рекомбинантный, антагониста, выделенная, экспрессирующий

Код ссылки

<a href="http://kzpatents.com/18-13277-rekombinantnyjj-polipeptid-so-svojjstvami-antagonista-receptora-il-1-vydelennaya-dnk-ekspressiruyushhijj-vektor-psf5-liniya-kletok-cos-sposob-polucheniya-polipeptida-farmacevtiches.html" rel="bookmark" title="База патентов Казахстана">Рекомбинантный полипептид со свойствами антагониста рецептора IL-1, выделенная ДНК, экспрессирующий вектор pSF5, линия клеток COS, способ получения полипептида, фармацевтическая композиция</a>

Похожие патенты