Скачать PDF файл.

Формула / Реферат

Изобретение относится к иммунологии, а именно к способу определения остаточного количества окситетрациклина в продуктах животноводства.
Технической задачей изобретения является усовершенствование способа определения окситетрациклина в животноводческой продукции, которая достигается за счет использования поликлональных специфических антител и сокращения периода тестирования.
В результате проведенных исследований было определено, что использованный способ позволяет проводить определение окситетрациклина в пределах - 0,00002 - 0,000010 мг/кг.

Текст

Смотреть все

(51) 01 33/53 (2011.01) 61 39/40 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ ЖИВОТНОВОДЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ ИММУНОФЕРМЕНТНЫМ МЕТОДОМ(57) Изобретение относится к иммунологии, а именно к способу определения остаточного количества окситетрациклина в продуктах животноводства. Технической задачей изобретения является усовершенствование способа определения окситетрациклина в животноводческой продукции,которая достигается за счет использования поликлональных специфических антител и сокращения периода тестирования. В результате проведенных исследований было определено, что использованный способ позволяет проводить определение окситетрациклина в пределах - 0,00002 - 0,000010 мг/кг.(72) Булашев Айтбай Кабыкешович Куйбагаров Марат Амангельдыевич Боровиков Сергей Николаевич Сураншиев Жанболат Амреевич Жумалин Айбек Хасиетович Абильмагжанов Абай Беркутович Бадуанова Салима Дулатовна(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(56) Мустафина Ш.А. Анализ методов обнаружения остаточного количества антибиотиков в пищевых продуктах. Журнала Ветеринария, 3, 2008, с. 73-75(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОКСИТЕТРАЦИКЛИНА В 25771 Изобретение относится к иммунологии, а именно к способу детекции окситетрациклина в животноводческой продукции. Стратегия анализа остаточного количества антибиотиков должна быть нацелена на охват самого широкого диапазона продуктов питания в наиболее короткий промежуток времени при ограниченной стоимости исследования. В таких обстоятельствах традиционные методы анализа не всегда приемлемы, т.к. они требуют наличия дорогостоящего оборудования,высококвалифицированных специалистов,значительных затрат реактивов и времени. Для определения антибиотиков в продуктах животноводства предложен ряд микробиологических, химических и физикохимических методов. Наиболее широкое применение в настоящее время нашли микробиологические методы определения минимальной концентрации антибиотиков в исследуемом материале. Существует метод диффузии в агар, основанный на свойстве антибиотика диффундировать из испытуемого образца в плотную питательную среду,засеянную определенной тест-культурой и подавлять рост этой культуры. В результате вокруг образца появляется зона задержки роста тестмикроба, свидетельствующая о наличии в образце антибиотика. Величина зоны зависит от химической природы и концентрации антибиотика,чувствительности тест-микроба,состава агаризованной среды, рН и других факторов,которые следует учитывать при разработке и практическом применении метода диффузии в агар Мустафина Ш.А. Анализ методов обнаружения остаточного количества антибиотиков в пищевых продуктах./Журнал Ветеринария, 3/2008 г. с. 73-75.). Предложен способ экспрессного определения антибиотиков в различных объектах, включающий инкубацию тест-культуры совместно с исследуемым объектом. При этом, с целью обеспечения возможности обнаружения антибиотиков в обсеменных живыми бактериями и/или их спорами образцах, в качестве тест-культуры применяют высокочувствительные к антибиотикам штаммы термофильных бактерий с оптимумом роста(50-60) С. (Способ экспрессного определения антибиотиков биологическим методом. Патент Российской Федерации 2188421, дата публикации заявки 2002.07.10). Не смотря на относительную надежность данной методики, она имеет и ряд существенных недостатков. К ним стоит отнести низкий уровень воспроизводимости результатов, необходимость постоянной поддержки в условиях лаборатории штаммов тест-культур и тест-микробов(материальные затраты на приготовление питательных сред, контроль стабильности свойств штаммов, энергетические затраты). Один из способов решения проблемы определения остаточных количеств ветеринарных препаратов использование метода 2 иммуноферментного анализа ( или ИФА),который уже 10 лет используется в странах ЕС,США и Японии и является основным скрининговым методом в этих странах (согласно директиве ЕС 2002/657, иммуноферментный анализ является рекомендованным скрининговым методом для определения остаточных количеств ветеринарных препаратов в продуктах животного происхождения в странах Европейского Союза). В связи со вступлением нашей Республики в ВТО, данная рекомендация будет обязательна для выполнения органами ветеринарно-санитарной службы РК. Наиболее близким техническим решением по совокупности признаков и достигаемому положительному эффекту является разработка ученых химического факультета Сеульского женского университета (Южная Корея). В описанном ими варианте детекции тетрациклина методом иммуноферментного анализа предлагается следующая схема. В лунки микропланшет вносят конъюгат овальбумина и тетрациклина (ОВА-ТЦ). Далее вносятся стандартные разведения тетрациклина или исследуемые пробы и первичные специфические антитела. После процедуры инкубирования и отмывки вносятся вторичные специфические антитела меченные биотином. Для выявления образовавшихся комплексов в систему вводится конъюгат авидина с ферментом пероксидазой хрена. Не смотря на довольно высокую степень чувствительности и специфичности данный вариант осложнен введением отдельного этапа с использованием системы биотин-авидин,что существенно увеличивает общее время постановки реакции (до 3,5 ч),, - ,- ,.--//88 (2008) 26-31). Предлагаемый способ получения детекции окситетрациклина предполагает использование специфических поликлональных антител. Технической задачей изобретения является усовершенствование способа определения окситетрациклина в животноводческой продукции за счет использования специфических поликлональных антител. Принцип метода основан на конкуренции свободного окситетрациклина(ОКСТ) из измеряемой пробы и ОКСТ,предварительно иммобилизованного на твердой фазе в составе белкового конъюгата, за центры связывания специфичных к ОКСТ антител. После отделения несвязавшихся реагентов количество антител, прореагировавших с иммобилизованным антигеном, определяют с помощью антивидовых антител, меченных пероксидазой хрена. Процедура получения поликлональных антител. Препараты конъюгатов окситетрациклина с овальбумином (ОВА) и бычьим сывороточным альбумином (БСА) получали активацией реагентов ацетатом натрия ( 5,5) и формальдегидом. Очистку конъюгатов от не связавшихся реагентов проводили на колонке (151,5 см) с сефадексом 25771 25. Элюирование проводили с помощью буфера (рН-7,5). При этом собирали фракцию относящуюся к первому пику и использовали в качестве антигена при иммунизации. Кроликов иммунизировали конъюгатом окститетрациклина с БСА (ОКСТ-БСА) с равным количеством неполного адъюванта Фрейнда по ниже указанной схеме- 31-й день - 1 мл антигена подкожно в область спины в 5 точек- 35-й день отбор крови для исследования. Для очистки сыворотки крови от антител,специфичных бычьему сывороточному альбумину проводили реакцию адсорбции. Для этого в сыворотку крови вносили БСА до концентрации 10 мг/мл, инкубировали в течение 2 ч при 37 и центрифугировали при 5000 об/мин - 10 мин. Для дальнейших исследований использовали супернатант. Определения окситетрациклина иммуноферментным методом приведено в следующем примере. Ячейки 96-луночного планшета для иммунологических реакций(,Дания) сенсибилизировали гетерологичным конъюгатом окситетрациклин-овальбумин (молекулярная масса 45 кД) в концентрации 0,005 мг/мл, при 4 в течение ночи. Для удаления несвязавшегося антигена планшет отмывали 3 раза фосфатносолевым буфером с содержанием 0,05 твина-20(ФСБ-ТВ). В два ряда лунок планшета вносили растворы калибровочных проб (КП) начиная с минимальной концентрации. В оставшиеся лунки вносили в дубликатах исследуемые образцы в объеме 0,05 мл. Во все лунки планшета внести по 0,05 мл рабочего раствора специфических антител. Планшет выдерживали при температуре 37 в течение 1 ч в термостате. Далее планшет отмывали описанным способом. Во все лунки планшета вносили по 0,1 мл рабочего раствора конъюгата. Плотно закрывали планшет крышкой и выдерживали при температуре 37 в течение 1 ч в термостате. Повторяли процедуру отмывки для удаления несвязанных продуктов реакции и в лунки вносили по 0,1 мл раствора субстрата фермента. Субстрат (однокомпонентный раствор тетраметилбензидина - ТМБ) вносили по 100 мкл и инкубировали планшет 10-15 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением в лунки планшет раствора 0,5 М серной кислоты. Результаты ИФА учитывали с помощью спектрофотометра с вертикальным потоком света(96, Австрия) при длине волны 450 нм. Для учета результатов строили калибровочную кривую зависимости оптической плотности от концентрации ОКСТ в калибровочных пробах(следует использовать логарифмический масштаб для оси абсцисс). Соединяли кривой (по лекалу) полученные точки. Рассчитывали средние арифметические значения показателей оптической плотности испытуемых образцов и по калибровочной кривой определяли в них концентрацию ОКСТ, учитывая фактор разбавления,который равен 100, для всех образцов. Общее время тестирования составляет 2,5 ч. Тестирование показало, что предложенный вариант иммуноферментного анализа позволяет проводить определение окситетрациклина в пределах - 0,00002 - 0,000010 мг/кг. Предлагаемый способ может найти применение при определении остаточных количеств окситетрациклина в продуктах животноводства. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ определения окситетрациклина в животноводческой продукции иммуноферментным методом, основанный на конкуренции свободного окситетрациклина (ОКСТ) из измеряемой пробы и ОКСТ, предварительно иммобилизованного на твердой фазе в составе белкового конъюгата, за центры связывания специфичных к ОКСТ антител,отличающийся тем,что выявление образовавшихся комплексов проводят с помощью антивидовых антител, меченных пероксидазой хрена.

МПК / Метки

МПК: G01N 33/53, A61K 39/40

Метки: способ, продукции, окситетрациклина, иммуноферментным, методом, животноводческой, определения

Код ссылки

<a href="http://kzpatents.com/3-ip25771-sposob-opredeleniya-oksitetraciklina-v-zhivotnovodcheskojj-produkcii-immunofermentnym-metodom.html" rel="bookmark" title="База патентов Казахстана">Способ определения окситетрациклина в животноводческой продукции иммуноферментным методом</a>

Похожие патенты