Молекула выделенной двуцепочной днк (варианты), способ получения генетически трансформированных растений, изолированный пептид (варианты), штамм бактерий, включающий молекулу двуцепочной днк, трансформированная растительная клетка

Номер патента: 12660

Опубликовано: 15.01.2003

Авторы: Джерард Фрэнцис БЭРРИ, Ганеш Мэрфи КИШОР

Есть еще 22 страницы.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

Обнаружены гены, кодирующие ферментглифосат оксидоредуктазу. Гены представляютценность для получения трансформированныхбактерий и растений, которые разрушают гербицидглифосат, а также культурных растений, которыетолерантны к гербициду глифосату.

Текст

Смотреть все

(51)7 12 15/33, 12 9/06, 12 15/82, 12 5/10, 12 1/21 ПАТЕНТНОЕ ВЕДОМСТВО РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(72) Ганеш Мэрфи КИШОРДжерард Фрэнцис БЭРРИ МОЛЕКУЛА ВЫДЕЛЕННОЙ ДВУЦЕ(54) ПОЧНОЙ ДНК (ВАРИАНТЫ), СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ РАСТЕНИЙ, ИЗОЛИРОВАННЫЙ ПЕПТИД (ВАРИАНТЫ), ШТАММ БАКТЕРИЙ,ВКЛЮЧАЮЩИЙ МОЛЕКУЛУ ДВУЦЕПОЧНОЙ ДНК, ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ РАСТИТЕЛЬНАЯ КЛЕТКА(57) Обнаружены гены, кодирующие фермент глифосат оксидоредуктазу. Гены представляют ценность для получения трансформированных бактерий и растений, которые разрушают гербицид глифосат,а также культурных растений, которые толерантны к гербициду глифосату. 12660 Данное сообщение является продолжением нашей незавершенной заявки под номером 07/543236 от 25 июня 1990 г. Последние успехи в генной инженерии обеспечили необходимые инструменты для трансформации растений, обуславливающей встраивание в их геном чужеродных генов. В настоящее время можно получать растения с уникальными характеристиками,представляющими большую ценность для сельского хозяйства. Несомненно, одним из таких полезных признаков является эффективный, в плане его дешевизны, контроль за присутствием в окружающей среде сорняков, основанный на толерантности растений к гербицидам. При наличии таких растений вовсе необязательно обрабатывать почву в целях борьбы с сорняками, что значительно снижает возможность почвенной эрозии. Одним из гербицидов такого типа, изучению которого были посвящены многие исследования, является -фосфонометилглицин, обычно называемый глифосатом. Глифосат оказывает ингибирующий эффект на путь обмена шикимовой кислоты, приводящий к синтезу ароматических соединений, включая аминокислоты и витамины. В частности, глифосат подавляет превращение фосфоенолпировиноградной кислоты и 3-фосфошикимовой кислоты в 5 енолпирувил-3-фосфошикимовую кислоту в результате ингибирования фермента синтазы 5-енолпирувил-3-фосфошикимовой кислоты ( синтазы или). Показано, что растения, толерантные к глифосату, могут быть получены путем встраивания в их геном факторов, обуславливающих способность этих растений синтезировать более высокие уровни ЕРР синтазы, фермента, который предпочтительно толерантен к глифосату ( с соавт., 1986). Введение в растения гена(генов) деградации глифосата может быть способом обеспечения толерантности к глифосату растений, а также повышение степени толерантности у трансгенных растений, которые уже экспрессируют толерантную к глифосатусинтазу в зависимости от физиологических эффектов продуктов деградации. Метаболизм глифосата (деградацию) изучали на различных видах растений, и в большинстве из этих исследований была показана малая степень деградации. В примерах, где сообщается о деградации, исходный продукт распада обычно представлен аминометилфосфонатом (АМРА) (, 1985 с соавт., 1987). Из этих примеров не совсем ясно, метаболизируется ли глифосат растением или присутствующими на поверхности листьев микробами, против которых глифоат применяется. Согласно сообщениям, АМРА характеризуется гораздо меньшей фитотоксичностью, чем глифосат для большинства видов растений (,1985), однако не для всех вообще (, 1983 с соав., 1988). Деградация глифосата в почвах являетя намного более обширной и быстрой (, 1985). Основным идентифицированным продуктом распада 2, 1977), фосфонат, который может быть метаболизирован многими микроорганизмами ( с соавт., 1963 с соавт., 1965 соавт., 1978 с соавт., 1979 а 1979 1979 с соавт., 1987 а). Был идентифицирован целый ряд чистых культур бактерий, которые расщепляют глифосат одним из двух известных путей( с соавт., 1983 соавт., 1984 и , 1986 и , 1986 и , 1987 соавт., 1987 ас соавт., 1987 ас соавт., 1987 с соавт.,1988 с оавт., 1985 и 1988 и ,1988 с соавт., 1988 и 1989 с соавт,1990 и , 1990 с соавт., 1990 с соавт., 1991). Согласно сообщениям, путь, включающий С-Р лиазу, которая разрушает глифосат до саркозина и неорганического ортофофата , характерен для видов( и , 1986 и , 1987) и видов( с соавт., 1987). Показано, что чистые культуры видов, 1988) способны расщеплять глифосат до АМРА. Кроме того, большое число изолятов, которые превращают глифосат в АМРА, было идентифицировано из промышленных активированных отстоев, рассматриваемых как отходы глифосата( с соавт., 1988). Однако до сих пор остаются неизвестными количество и природа бактериальных генов, ответственных за вышеуказанную деградацию и, кроме того, ни один из них не изолирован. Следовательно, один из аспектов изобретения заключается в обеспечении новыми генами, кодирующими глифосат метаболизирующий фермент, посредством которого глифосат превращается в аминометилфосфонат и глиоксилат. Другой целью изобретения является повышение активности глифосат метаболизирующего фермента в отношении глифосата путем замещения специфических аминокислотных остатков. Ещ один аспект изобретения заключается в получении генетически модифицированных растений,в которых экспрессируется ген, кодирующий глифосат метаболизирующий фермент и которые характеризуются повышенной толерантностью к глифосатному гербициду. Другой задачей изобретения является показать,что глифосат метаболизирующий фермент может быть мишенью пластид, используя транзитные белки хлоропластов, и что такие ферменты-мишени пластид обусловливают высокий уровень толерантности к глифосату. Следующий аспект изобретения связан с разработкой метода выбора ткани трансформированного растения, использующей глифосат метаболизирующий фермент в качестве селективного маркера в присутствии ингибирующих концентраций глифосата. 12660 Эти и другие цели, аспекты и характеристики изобретения станут очевидными для специалистов из следующего описания и рабочих примеров. Изобретение обеспечивает структурные конструкции ДНК, которые кодируют фермент глифосат оксидоредуктазу и которые обусловливают у гетерологичных микроорганизмов (т. е. бактерий и растений) способность к деградации глифосата, а также получение толерантных к глифосату растений. В дополнение к вышесказанному, согласно одному из аспектов изобретения, обеспечивается способ получения генетически трансформированных растений, которые характеризуются толерантностью в отношении к гербициду глифосату, включающий следующие этапы а) встраивание в геном растительной клетки рекомбинантной двухцепочечной молекулы ДНК, в состав которой входят промотор, функционирующий в растительной клетке для индуцирования синтеза РНК последовательности, структурная ДНК последовательность, обусловливающая синтез РНК последовательности, которая кодирует фермент глифосат оксидоредуктазу, 3 нетранслируемая ДНК последовательность, посредством которой в растительных клетках осуществляется добавление полиаденилированных нуклеотидов к 3 концу РНК последовательности где промотор является гетерологичным в отношении к кодирующей последовательности и адаптируется для индукции достаточной экспрессии указанного фермента в ткани растения, включая меристематическую ткань, с целью повышения резистентности к глифосату растительной клетки, трансформированной указанным геном б) получение трансформированной растительной клетки и в) регенерирование из трансформированной растительной клетки генетически трансформированного растения, которое характеризуется повышенной толерантностью к гербициду глифосату. В соответствии с другим аспектом, изобретение обеспечивает получение рекомбинантной, двухцепочечной ДНК молекулы, последовательно включающей а) промотор, функционирование которого в растении обусловливает синтез РНК последовательности б) структуру ДНК последовательности, которая индуцирует синтез РНК последовательности, кодирующей фермент глифосат оксидоредуктазу, и в) 3 нетранслируемый участок, посредством которого в растениях осуществляется присоединение полиаденилированных нуклеотидов к 3 концу РНК последовательности. Кроме того, в соответствии с изобретением получены бактериальные и трансформированные растительные клетки, которые содержат ДНК, соответственно, включающую вышеупомянутые элементы (а),(б) и (в). В соответствии с еще одним аспектом изобретения, были получены дифференцированные растения,которые состоят из трансформированных растительных клеток, описанных выше и обладающих толерантностью в отношении к гербициду глифосату. Согласно другому аспекту, изобретение обеспечивает метод селективного контролирования сорняков в поле с посадками агрокультур в виде семян или растений, причем метод включает следующие стадии а) посадка указанных семян агрокультур или растений, которые характеризуются толерантностью к глифосату, обусловленной встраиванием в семя культуры или в само растение рекомбинантной двухцепочечной молекулы ДНК, причем данная молекула включает последовательность промотора, который индуцирует в растении синтез РНК последовательности, структуру ДНК последовательности, которая ответственна за синтез РНК, кодирующей фермент глифосат оксидоредуктазу, 3 нетранслируемый участок, который кодирует сигнал полиаденилирования, обеспечивающий в растении присоединение полиаденилированных нуклеотидов к 3 концу РНК последовательности,где промотор гетерологичен по отношению к кодирующей последовательности и предназначен для обеспечения достаточной экспрессии указанного фермента в ткани растения, включая меристематическую ткань, в целях повышения толерантности к глифосату трансформированных растений, клетки которых содержат указанный ген, и б) обработка указанных культуры и сорняков в вышеупомянутом поле достаточным количеством гербицида глифосата с целью контроля за указанными сорняками без значительных повреждений культурных растений. В наиболее предпочитаемом варианте, двухцепочечная ДНК молекула, содержащая ген экспрессии растения, включает структуру последовательности ДНК, кодирующую слитый полипептид, содержащий аминоконцевой транзитный пептид хлоропластов, который обеспечивает поступление фермента карбокситерминальной глифосат оксидоредуктазы в хлоропласт растительной клетки, осуществляя экспрессию указанного гена. Следующий аспект изобретения касается использования гена глифосат оксидоредуктазы в качестве селективного маркера для выбора и идентификации трансформированной ткани растения. Описание фигур На фиг. 1 представлена ДНК последовательность для полного промотора мозаичного вируса норичника шишковатого . На фиг. 2 представлена структура ДНК последовательности гена глифосат оксидоредуктазы из бактериального изолята . На фиг. 3 отражены результаты сравнения структуры гена глифосат оксидоредуктазы, подвергавше 3 12660 гося манипуляциям, с модифицированным геном глифоат оксидоредуктазы с высокой степенью экспрессии в растениях. Ген глифосат оксидоредуктазы,подвергавшийся манипуляциям, представлен в качестве верхней ДНК последовательности. И только изменения, полученные в модифицированном гене,показаны в нижних последовательностях. На фиг. 4 структура гена глифосат оксидоредуктазы, подвергавшегося обработке, сравнивается с синтетическим геном глифосат оксидоредуктазы, и характеризуется повышенной экспресией в растениях. Подвергнутый манипуляциям ген глифосат оксидоредуктазы изображен в качестве верхней ДНК последовательности. На фиг. 5 представлена структура рМО 17032,причем рМО 886 вектор содержит модифицированный глифосат оксидоредуктазный ген, встроенный в качестве -35 - модифицированной глифосат оксидоредуктазной -3 кассеты всайт вектора. р 886 вектор описан в тексте. На фиг. 6 представлена нуклеотидная последовательность для транзитного пептидахлоропласта, происходящая изгена из . . Фиг. 7 представляет генно-структурную карту плазмиды рМО 17066, при этом вектор 979 типа содержит ген, кодирующий слитый пептид ХТП/синтетическая глифосат оксидоредуктаза. Производные, родственные рМ 979 типу, представлены рМО 17065 и рМО 17073. На фиг. 8 представлена генно-структурная карта плазмиды р 17138, пример вектора типа 981, содержащего ген, кодирующий слитый полипептид ХТП/синтетическая глифосат оксидоредуктаза. В данном примере ген ТП 1-синтетической глифосат оксидоредуктазы клонировали в рМО 979 в качестве Х-фрагмента. На фиг. 9 представлена нуклеотидная последовательность ХТП 2 транзитного пептида хлоропласта,полученная изгена из . . Фиг. 10 представляет структурную карту плазмиды 17159. Фиг. 11 представляет структурную карту плазмиды 17226. Фиг. 12 представляет структурную карту плазмиды 17164. Описание изобретения Экспрессия гена растений, представленного в виде двухцепочечной ДНК, включает синтез матричной РНК (мРНК) на одной из цепей ДНК с использованием фермента РНК-полимеразы и последующий процессинг мРНК первичного транскрипта внутри ядра. В этот процесс включается 3 сигнальный участок, обеспечивающий присоединение нуклеотидов полиаденилата к 3 концу РНК. Транскрипция ДНК в мРНК находится под контролем участка ДНК, названным промотором. Область промотора содержит последовательность оснований, обеспечивающих поступление сигналов о 4 взаимодействии РНК полимеразы с ДНК, что приводит к инициации транскрипции мРНК при использовании одной из цепей ДНК в качестве матрицы, в результате чего осуществляется синтез соответствующей комплементарной цепочки РНК. В литературе описан ряд промоторов, активных в растительных клетках. Сюда относятся промоторы нопалинсинтазыи октопининтазы (ОС)(которые находятся в индуцирующих опухоли плазмидах), промоторы каулимовирусов, такие как промоторы мозаичных вирусов цветной капусты (СаМ) 19 и 35, а также промотор мозаичного вируса норичника шишковатого 35, легко индуцибельный промотор из малой субъединицы рибулоза бисфофат карбоксилазы (, очень распространенного полипептида растений). Каждый из этих промоторов был использван для получения различных типов ДНК конструкций, экспрессирующихся в растениях см.,например, сообщение РСТ 84/02913 (соавт., Монсанто). В изобретении можно использовать промоторы,которые уже известны или которые идентифицируют с целью индукции транскрипции ДНК в растительных клетках. Такого типа промоторы могут быть получены из разнообразных источников, как, например, растений и ДНК вирусов растений, и включать,правда, не ограничиваясь только этими,35 и 35 промоторы, а также промоторы, изолированные из генов растений, таких какгены или гены хлорофил а/ связывающих белков. Согласно вышесказанному, предпочтительно, чтобы выбранный специфический промотор был способен к индукции достаточной экспрессии, обусловливающей синтез эффективных количеств глифосат оксидоредуктазы, необходимых для получения растения,характеризующегося значительной толерантностью к глифосатным гербицидам. Количество глифосат оксидоредуктазы, требующееся для достижения желаемой степени толерантности, часто варьирует в зависимости от вида растения. Предпочтительно, чтобы используемые промоторы обладали довольно высокой степенью экспрессии во всех меристематических тканях, помимо других тканей, поскольку в настоящее время известно, что глифосат перемещается и накапливается именно в данном типе растительной ткани. В качестве альтернативы может быть использована комбинация химерных генов, которая приведет в совокупности и к необходимому общему уровню экспрессии фермента глифосат оксидоредуктазы и к получению фенотипа,толерантного к глифосату. мРНК, синтезируемая на ДНК конструкции изобретения, содержит также 5 нетранслируемую лидерную последовательность. Эта последовательность может быть получена из промотора, выбранного для экспрессии гена, и специфически модифицирована таким образом, чтобы увеличить объем трансляции мРНК. 5 нетранслируемые участки можно также получать из вирусных РНК, из подходящих генов 12660 эукариот или из синтетических генных последовательностей. Изобретение не ограничено исключительно конструкциями, о которых сообщается в последующих примерах, где нетранслируемая область происходит как из 5 нетранслируемой последовательности, которая следует за последовательностью промотора, так и из части 5 нетранслируемого фрагмента гена белка вирусной оболочки. Скорее же всего, как рассматривалось выше, нетранслируемая лидерная последовательность может быть получена из чужеродного промотора или кодирующей последовательности. Предпочтительным промотором, используемым в изобретении, является промотор полного транскрипта (35 ) из мозаичного вируса норичника ,который функционирует в качестве сильного и постоянного промотора химерных генов, встраиваемых в растения, в частности, двудольные. Обычно полученные трансгенные растения экспрессируют белок, кодируемый встроенным геном, на более высоком и постоянном уровне во всех тканях и клетках, чем тот же ген, контролируемый усиленным 35 промотором. Согласно фиг. 1, ДНК последовательность промотора локализуется между нуклеотидами 6368 и 6930 (ПОС.1)генома. 5 нетранслируемая лидерная последовательность предпочтительно связана с промотором и типично лидерной последовательностью (ПОС.2), что видно из фиг. 1. Лидерная последовательность может быть производнойгенома или чужеродныхгеномных источников. 3 нетранслируемый участок гена химерного растения содержит сигнал полиаденилирования, который обеспечивает присоединение полиаденилированных нуклеотидов к 3 концу РНК. Примерами подходящих 3 участков являются (1) 3 транскрибируемые, нетранслируемые фрагменты, содержащие сигнал полиаденилирования генов индуцирующей опухоль (Т) плазмиды у , таких как гена нопалин синтазыи (2) гены растений, такие как гены резервных белков соевых бобов и малая субъединица гена рибулоз-1,5-бисфосфат карбоксилазы . В качестве примера предпочитаемого 3 участка можно привести фрагмент изгена гороха (Е 9), более детально описанного в нижеприведенных примерах. Конструкции ДНК изобретения также содержат структуру кодирующей последовательности в виде двухцепочечной ДНК, которая кодирует фермент глифосат оксидоредуктазу, ответственный за превращение глифосата в аминометилфосфонат и глиоксилат. Фермент глифосат оксидоредуктаза катализирует расщепление С- связи глифосата, приводя к образованию аминометилфосфоната (АМРА) и глиоксилата в качестве продуктов реакции. В аэробных условиях в качестве коубстрата реакции используется кислород. В этих же условиях стимуляторами реакции могут быть другие носители электронов, такие,как феназин метосульфат и кофермент . В отсутст вии кислорода эти факторы выполняют роль акцепторов электронов. Энзиматическая реакция может быть изучена в пробе поглощения кислорода с использованием кислородного электрода. Глифосат оксидоредуктаза изне приводит к образованию перекиси водорода как продукта восстановления кислорода. Фермент характеризуется стехиометрией из двух молей окисленного глифосата на моль потребленного кислорода и образует два моля как АМРА, так и глиоксилата в качестве продуктов реакции. Альтернативный метод для испытания глифосат ксидоредуктазы включает реакцию пробы с 2,4 динитрофенилгидразином и определение количества глиоксилат-2,4-динитрофенилгидрозона путеманализа, что более детально будет описано в последующих разделах. Третий метод для испытания глифосат оксидоредуктазы состоит в использовании 3-14-глифосата в качестве субстрата радиоактивный АМРА, полученный с помощью фермента, изолируется из субстрата путемна ионно-обменной колонке, что будет описано ниже. Радиоактивность, связанная с АМРА, является показателем степени завершенности реакции с глифосат оксидоредуктазой. Глифосат оксидоредуктаза из ВАА является флавопротеином, использующимв качестве кофактора. Согласно нашему предположению, один из механизмов реакции, катализируемой данным ферментом, заключается в уменьшениив активном сайте фермента под влиянием глифосата. Это приводит к образованию редуцированногои шиффового основания аминометилфофоната с глиокилатом. Шиффовое основание гидртируется водой и гидролизируется с образованием компонентов, АМРА и глиоксилата. Восстановленный флавин вновь окисляется молекулярным кислородом. Мы предполагаем, что в ходе процесса повторного окисления восстановленногообразуется оксигенированный флавин в качестве промежуточного соединения. Этот промежуточный флавин может катализировать насыщение кислородом глифосата, что приводит к образованию АМРА и глиокилата. Эта гипотеза находится в соответствии с обнаруживаемой стехиометрией и нашей неспособностью выявить перекись водорода в реакционной смеси. Помимо глифосата, фермент глифосат оксидоредуктаза изокисляет иминоацетоукусную кислоту (ИАУК) до глицина и глиоксилата. Скорость реакции с ИАУК значительно выше, чем с глифосатом. Изолирование бактерий, эффективно расщепляющих глифосат до АМРА В настоящее время известны бактерии, способные расщеплять глифосат ( с соавт., 1988 с соавт., 1989). Целый ряд этих бактерий был подвергнут скринингу на быстрое расщепление глифосата путем следующей процедуры 23 бактери 5 12660 альных изолята переносили из ТСА (Триптиказа Соевый Агар ) чашек в среду А, включающую среду с Дворкин-Фостерасолями, содержащую глюкозу, глюконат и цитрат (каждого по 0,1 ) в качестве источника углерода, а также содержащую глифосат в количестве 0,1 м в качестве источника фосфора. Минимальную среду Дворкин-Фостера готовили путем смешивания в 1 л (автоклавированной воды) по 1 мл каждого из составов А, В и С и 10 мл ,тиамин НС (5 мг), С-источников до конечных концентраций 0,1 каждого и Р-источника (глифосата или другого фосфоната или Р) до требуемой концентрации. (4)24 (разведение Х 100 на 100 мл автоклавирование) 20 г Дрожжевой экстракт добавляли (УЕ Дифко) до конечной концентрации 0,01 или 0,001 . Каждый мл культуральной среды также содержал примерно 200000 ср 3-14 глифосата(Амершам .745). Культуры инкубировали при 30 С при постоянном встряхивании. Изолятобнаружил значительный рост в течение одного дня,в то время как другие тест культуры характеризовались слабым ростом до третьего дня. Определение радиоактивности (путем сцинтилляционного подсчета) в культуре, клеточном осадке и супернатанте культуры (на 4 день) показало снижение общей 14 С радиоактивности, причем оставшаяся радиоактивность распределялась примерно 11 между супернатантом и осадком, что подтверждает значительное поглощение и метаболизм глифосата. Таблица 1 Метаболизм глифосата вкультуре Проба Контролькультурасупернатантклетки На 5-й день 75 мкл супернатанта культуры из всех тест культур подвергали анализу путемследующим образом использовалиА Х 100 анионно обменную колонку подвижная фаза, включающая 65 мМ КН 2 РО 4 (рН 5,5 св зависимости от требований эксперимента концентрация фосфатного буфера варьировала от 50 до 75 мМ в целях изменения времени задержки мате 6 риала), продвигалась изократически и элюированный материал подвергали непрерывному контролю,используя детектор радиоактивности. Анализ показал, что в одном изоляте (в частности ) пик глифосата (время задержки З 7,0 минут в данном анализе) полностью отсутствовал, но полявился новый пик радиоактивности с ВЗ, сходным с ВЗ метиламина или -ацетилметиламина (ВЗ 3,5 минут). Оценку сбора бактерий, часть которого составлял штамм , производили по степени расщепления глифосата до АМРА ( с соавт., 1988) обнаружение метиламина или -ацетилметиламина предполагает, что АМРА или -ацетилАМРА метаболируются с помощьюС-Р лидазой активности,в результате чего выделяется фосфат, необходимый для обеспечения роста в данном эксперименте. Штаммбыл изучен более детально. Превращение глифосата в АМРА в микробных изолятах Для ясности и краткости представления открытия, описание процедуры выделения генов, кодирующих ферменты глифосат оксидоредуктазы, сводится к описанию изолирования такого гена из бактериального изолята . Для специалистов станет понятным, что та же самая или сходная тактика может быть применена для изолирования таких генов из других микробных изолятов. Путь обмена с расщеплением глифосата в покоящихся клетках культивируемого в присутствии глифосата штаммахарактеризуется следующими чертами клетки из 100 мл культуры ,инкубируемой всреде в присутствии глюкозы,глюконата и цитрата в качестве источников углерода, тиамина, дрожжевого экстракта (0,01 ) в следовых количествах (среда 3) а также в присутствии глифосата в концентрации 0,2 мМ в качестве источника фосфора, собирали при КЛЕТТ 200,дважды промывали 20 мл среды 3, и эквивалент из 20 мл клеток ресуспендировали в 100 мкл той же среды, содержащей 3-14 глифосата (2,5 мкл 52 микрокюри/милимоль). Клеточную смесь инкубировали при 30 С при постоянном помешивании и через определенные интервалы собирали пробы(20 мкл). Пробы центрифугировали и полученные осадок и супернатант подвергали ВЭЖХ анализу(осадок клеток ресуспендировали в 100 мкл кислой 3 3, 0,65 Н , подвергали кипячению в течение 5 мин, краткому центрифугированию, после чего исследовали полученный супернатант в качестве контроля изучали подкисленный глифосат). За два часа количество радиоактивности в глифосатном пике (ВЗ 7,8 мин) супернатанта снижалось примерно до 33 исходного уровня около 3 глифосата было обнаружено в пределах клеток. Материал, одновременно элюировавший с метиламиновым стандартом, составил примерно 5 от исходной метки в супернатанте и около 1,5 в клеточном осадке. Новый пик, составляющий около 1,5 от исходной 12660 радиоактивности с ВЗ 7,7 минут (ВЗ глифосата 8,9 минут в условиях подкисления данного эксперимента) был обнаружен в клеточном содержимом. Сильное снижение общей радиоактивности предполагает,что глифосат метаболизируется в данном эксперименте со значительной скоростью. В дальнейшем эксперименте удалось выяснить ряд деталей, касающихся пути обмена, путем сравнительного изучения метаболизма 14 АМРА и 3-14 глифосата(см. выше), в покоящихся клетках, собранных при КЛЕТТ 165 и ресуспензированных в эквиваленте 15 мл клеток на 100 мкл 3 среды. Изучение проб проводили путем ВЭЖХ анализа, причем пробы состояли из целых культур, подкисленных и обработанных, как описано выше. В течение первых двух часов эксперимента с глифосатом, 25 радиоактивности было обнаружено в метиламин/-ацетилметаламиновом пике (ВЗ 4,8 мин), 12,5 в качестве АМРА (ВЗ 6,4 мин), 30 в качестве вышеупомянутого пика (ВЗ 9,4 мин) и 30 в качестве глифосата (ВЗ 11,8 мин). В АМРА эксперименте 15 радиоактивности приходится на -ацетилметиламин/метиламин, 59- на АМРА и 18 обнаруживается в пике с ВЗ 9,4 мин. Модифицированная форма АМРА определяется как -ацетилАМРА. Сходная стадия ацетилирования была результатом продуктов, идентифицированных в ., культивируемой в присутствии аминометилфосфонатов в качестве источников фосфора (., 1987). Эти данные показывают, что путь расщепления глифосата ввключает следующие ступени глифосатАМРА/метиламин/-ацетилАМРАацетилметиламин. Клонирование Глифосат оксидоредуктазного гена (генов) в . После установления факта превращения глифосата в АМРА в линиибыл разработан прямой подход для клонирования гена(генов), участвующих в данном процессе, в . с. Поскольку отсутствовали какие-либо другие методы, то были использованы обычные для этих целей клонирование и генетические методы, описанныес соавт., 1982. Методика клонирования заключается в следующем введение космидного банка линиив . с и селекция гена/генов, ответственных за превращение глифосата в АМРА, по необходимой степени роста на среде, включающей глифосат в качестве источника фосфора (Р). Этот отбор основан на использовании АМРА, полученном при помощи фермента,метаболизирующего глифосат в качестве источника фосфора (Р), что сопровождается выделениемиз АМРА посредством .С-Р лиазы. Большинство штаммов .не способны к утилизации фосфонатов в качестве Р источников в первичных культурах, однако они очень быстро адаптируются, независимо от , к утилизации фосфонатов (становясь ) ( с соавт., 1987). . сизолировали из .200 (, , , ,, , ) следующим образом объем свежей-бульонной культуры .200 помещали на( с соавт., 1974) сложный агар (т. е. содержащий -лейцин и -пролин в количестве 25 мкг/мл и витамин В 1 (тиамин) в количестве 10 мкг/мл агарДИФКО Очищенный), содержащий аминометилфосфонат (АМРА 0,2 мМ Сигма) в качестве источника фосфора.среда включает 10 мл 10 Хсоли 2 мл 0,5 мг/мл Тианин 1 мл 20 глюкозы 10 Хсоли включают на 100 мл 40 мл 1 МрН 7,4 4 мл 1 М Трицина рН 7,4 1 мл 0,01 М 472 5 мл 1,9 М 4 1 мл 0,276 М 24 1 мл 0,5 мМ 2 1 мл 0,528 М 2 10 мл 5 М 1 мл 0,5-Метионина 1 мл микроэлементов Микроэлементы включают 3 х 10-9 М (4)6724 4 х 10-7 М Н 3 ВО 4 3 х 10-8 М 2 1,6 х 10-8 М 4 8 х 10-8 М 2 1 х 10-8 М 4 После трех дней инкубации при 37 С 6 отдельных колоний были посеяны штрихом с вышеуказанной чашки наполный агар, содержащий или АМРА, или метилфосфонат (Альфа) в качестве источника фосфора. Одна колония, обозначенная как.200 , была выбрана из всех колоний,показавших одинаково однообразный рост на обеих средах с фосфонатом. Хромосомную ДНК готовили из штаммаследующим образом клеточный осадок из 100 мл бульонной (, 1972) культуры в поздней логарифмической фазебыл ресуспендирован в 10 мл раствора 1 ( и , 1979). Затем добавляли ДСН до конечной концентрации 1 , и суспензию подвергали трехкратному замораживаниюоттаиванию, причем каждый такой цикл включал погружение в сухой лед на 15 мин и затем в воду при 70 С на 10 мин. Полученный лизат четырехкратно эктрагировали одинаковыми объемами фенолхлороформа (11 фенол, насыщенный ТЕ)(ТЕ 10 мМ Трис рН 8,0 1,0 мМ ЭДТК), и фазы отделяли путем центрифугирования (1500010 мин). Обработанный этанолом материал осаждался из супернатанта путем кратного центрифугирования (80005 мин) с последующим добавлением двух объемов этанола. Осадок ресуспензировали в 5 мл ТЕ и диализовали в течение 16 часов при 4 С против 2 л ТЕ. Эта процедура позволила получить 6 мл ДНК раствора 150 мкг/мл. 7 12660 Частично рестрикционная ДНК была приготовлена следующим образом три пробы ДНКобъемом 100 мкг обрабатывали в течение часа при 37 С рестрикционной эндонуклеазойв дозах 4, 2 и 1 единиц фермента на мкг ДНК, соответственно. Пробы собирали, готовили 0,25 мМ растворы ДНК с ЭДТК и экстрагировали равным объемом фенолхлороформа. После добавленияацетата и этанола ДНК осаждали двумя объемами этанола и получали осадок путем центрифугирования (1200010 мин). Высушенный осадок ДНК ресуспендировали в 500 мкл ТЕ и наслаивали на 10-40 сахарозный градиент (на 5 прироста по 5,5 мл) в 0,5 М, 50 мМ Трис рН 8,0, 5 мМ ЭДТК. После центрифугирования в течение 20 часов при 26000 об/ мин с использованием 28 ротора и прокола пробирок были собраны фракции объемом в 1 мл, 15 мкл пробы каждой третьей фракции исследовали в 0,8 агарозном геле, и размер ДНК определяли путем сравнения с линейной лямбда ДНК иобработанными лямбда ДНК стандартами. Фракции,содержащие 25-35 кб фрагменты ДНК были собраны, подвергнуты обессоливанию на колонках с АМИКОНОМ 10 (7000 об/ мин 20 С 45 мин) и сконцентрированы путем преципитации. Данная процедура дала 50 мкгДНК требуемого размера. ДНК плазмиды рНС 79 ( и , 1980) и обработанный -фосфатазой вектор готовили согласно описанию ( с соавт., 1982). Условия лигирования были следующие вектор ДНК (обработанныйи щелочной фосфатазой теленка) 1,6 мкг размер фракцинированныхфрагментов 10 Х буфер лигировния 250 мМ Трис-, рН 8,0 100 мМ 2 100 мМ дитиотреитол 2 мМ Спермидин Т 4 ДНК лигаза Н 2 О до 22,0 мкл 18 час при 16 С. Лигированная ДНК (4 мкл) была упакована в частицы лямбда фага ,используя метод изготовителя. Культура .200 , которая росла в течение ночи в -бульоне (с мальтозой 0,2 ), была инфицирована 50 мкл упакованной ДНК. Трансформанты были отобраны насложном агаре,содержащем ампициллин и глифосат в концентрации 0,2 мМ в качестве источника Р. 8 Пробы определенных объемов также помещали на( с соавт., 1974) сложный агар с ампициллином, содержащийв концентрации 1 мМ титрования упакованных космид. На данной среде через 2 дня инкубации при 37 С космидные трансформанты были изолированы в объеме, примерно, 105 на мкг/ДНК. На агаре,содержащем глифосат, колонии появлялись с 3 до 10 дня с конечной концентрацией 1 на 200-300 космид. Плазмидная ДНК была приготовлена из 21 космидных трансформантов, образовавшихся в чашках с глифосатом. Эти космиды можно было разделить,по крайней мере, на два класса, основываясь на типерестрикции плазмидной ДНК. В классекаждая из космид обычно клонировала 6,4 и 4,2 кб фрагментырестрикции, а в классе- фрагменты - около 23 кб. Десять космид, представляющие разнообразные клонируемые фрагменты, были ретрансформированы в .200 , и утилизация глифосата проверялась путем отбора на рост насложном агаре, содержащем ампициллин и глифосат. Кроме того, определяли конечную плотность клеток, которая достигается в культуре, использующей глифосат (0,2 мМ всреде) в качестве источника Р, и только небольшие различия можно было выявить между отдельными трансформантами. Трансформанты также вводились всложный бульон с АМРА в концентрации 0,1 мМ в качестве источника фосфора (чтобы гарантировать наличие С-Р лиазной активности) и через 24 часа инкубации при 37 С выполняли стократное разведение всложной среде с глифосатом в концентрации 0,1 мМ и 3-14 глифосатом (40000 имп. в мин/мл). Все содержащие космиды клетки расщепляли глифосат и образовывали -ацетил АМРА и ацетилметиламин с небольшими различиями в скорости. В этих тестах в супернатанте культуры был обнаружен -ацетилАМРА. Одна из космид класса, идентифицированная как рМО 7468, была выбрана для дальнейшего исследования. Второй глифосат оксидоредуктазный ген был идентифицирован из клона класса . Свободные от клеток лизаты .200/ 7468 были получены из клеток, росших насложной среде с глифосатом при 1,0 мМ (с добавлением -фенилаланина, -тирозина и триптофана при концентрации каждого 100 мкг/мл и пара-оксибензойной кислотой, 2,3-диоксибензойной кислотой и пара-аминобензойной кислотой с концентрацией каждой 5 мкг/мл, для снижения к минимуму эффектов ингибирования .синтазы). Клеточный осадок (около 0,5 г влажного веса) ресуспензировали в 1 мл лизирующего буфера(40 мМ , рН 7,4 4 мМ трицина, рН 7,4 10 глицерина 1 мМ ДТТ) и пропускали дважды через Френч Пресс. Клеточные остатки удаляли путем центрифугирования при 15000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант исследовали после добавления 2 к 10 мМ для разрушения меченого глифосата. Субстрат глифосат использовали в качестве 3-14 12660 глифосата (конечная концентрация - 17 мкМ). Обнаруживаемые продукты были представлены, в основном, АМРА и некоторым количеством -ацетил АМРА производство АМРА является показателем клонирования ферментативной активности из штамма , однако наличие -ацетилАМРА могло быть обусловлено .эндогенной активностью ( с соавт., 1987). Специфическая активность для образования в этих условиях АМРА составляла 13,3 пмолей АМРА/мин. мг белка. Характеристика глифосатАМРА гена Область клонирования, ответственная за данную активность фермента глифосат оксидоредуктазы,была затем локализована в плазмиде. Делеции рМО 7468 были изолированы первично в пределах клонируемой области путем использования ферментов рестрикции, которые иногда производят разрезание внутри вставки следующим образом пробы плазмидной ДНК 0,5-2 мкг подвергали полному расщеплению с использованием эндонуклеаз рестрикции , ,или , с последующей экстракцией фенол-хлороформом, осаждением этанолом, ресуспензированием в ТЕ буфере и лигированием в течение 2-4 часов при комнатной температуре (или в течение 18 часов при 16 С) в конечном объеме 50 мкл лигирующего буфера и Т 4 ДНК лигазы. Трансформанты подвергались селекции в .200 , после чего эти делеции исследовались на потерю или торможение фенотипов, утилизирующих глифосат. Эти данные в сочетании с рестрикционным картированием клонов были использованы для локализации активной области по соседству с центральной частью вставки в 7468, которая включала два обычныхфрагмента (6,4 и 4,2 кб). Далее фрагментырестрикции из этой области были субклонированы ви их глифосатный фенотип определяли в .101( производное 101 выделяли согласно описанию для 200 ). Клоны, содержащие 6,4 кбфрагмент, в любой ориентации, были способны к утилизации глифосата. Поле рестрикционного картирования этогофрагмента, была изолирована серия клонов с делецией из двух 6,4 кбклонов при использовании ферментов, которые иногда производят разрезание во вставке, а также в области полилинкера. Были также подвергнуты субклонированию ряд фрагментов рестрикции,внутренних по отношению кфрагменту. 3,5 кби 2,5 кбфрагменты, в любой ориентации, обладали способностью к утилизации глифосата. Эти данные в сочетании с данными о делециях были использованы для локализации активной области непосредственно вблизи 1,8 кб фрагмента. Кроме того, делеции, полученные из 6,4 кбфрагмента, характеризовались минимальным размером кодирующей области, примерно 0,7 кб, сисайтами, возможно, локализованными в пределах кодирующих последовательностей. Направление транскрипции/экспрессии локуса,ответственного за активность фермента, обуславливающего превращение глифосата в АМРА, определяли следующим образом .101 трансформанты 74691 и 4 (клоны 2,5 кбфрагмента всайте 118 противоположная ориентация) росли в М 9 - глюкозо-тиаминампициллин бульоне, в присутствии и безиндуктора , материал собран в поздней логарифмической фазе (Клетт 190-220) готовили, как описано выше, свободные от клеток лизаты четырех культур, которые затем исследовали на активность,ответственную за превращение глифосата в АМРА при наличии 17 мкМ глифосата. Самая высокая ферментативная активность была получена для 74691 плюс , гдесайт располагается дистально в , тем самым предполагая, что гены экспрессируются вкнаправлении. Таблица 2 Активность, ответственная за превращение глифосата в АМРА,в свободных от клеток лизатах трансформатов . Клон 74691746917469474694 добавлен Нет Да Нет Да Единственный обнаруженный продукт был представлен АМРА, тем самым показывая, что АМРА ацетилирующая активность, которая, как описано ранее, была индуцирована в .трансформантах, инкубированных на глифосате в качестве Р источника. В более позднем эксперименте клеточные лизаты 74691 и 7470 (- 1,8 кб в 118 образованном из 74691 путем делеции 700 нп - фрагмента) были изучены на активность, ответственную за превращение глифосата в АМРА, в присутствии 2 мМ глифосата(сп. акт. 3-14 глифосат 3,7 миликюри/милимоль 0,2 мккюри/реакция культуры росли в присутствиив среде), при этом была зарегистрирована намного более высокая ферментативная активность, указывающая на более благоприятные условия испытаний. 9 12660 Таблица 3 Активность, ответственная за превращение глифосата в АМРА,в свободных от клеток лизатах трансформантов . с Клон 746917470, 1985), после клонирования этого фрагмента всайт в векторе ,( 7471 1, 2 противоположенные ориентации). Опытные и контрольные плазмиды были трансформированы в .К 38, содержащие 12 ( и , 1985) и инкубировали при 30 С в -бульоне (2 мл) в присутствии ампициллина и канамицина (100 и 50 мкг/мл, соответственно) до показаний Клетт около 50. Определенный объем удаляли и клетки собирали путем центрифугирования, отмывали М 9 солями (, 1972) и ресуспендировали в 1 мл М 9 среды, содержащей глюкозу(0,2 ), тиамин (20 мкг/мл) и 18 аминокислот по 0,01(кроме цистеина и метионина). После инкубации при 30 С в течение 90 мин культуры переносили в водяную баню при 42 С и выдерживали в этих условиях в течение 15 мин. Затем добавляли рифампицин (Сигма) до концентрации 200 мкг/мл и культуры еще дополнительно инкубировали 10 мин при 42 С, после чего их переносили на 20 мин в условия 30 С. Пробы выдерживали с 10 мккюри 35-метионина в течение 5 мин при 30 С, клетки собирали путем центрифугирования и суспензировали в 60-120 мкл крегинг буфера (60 мМ Трис 6,8/1 ДСН/12-меркаптоэтанол/10 глицерин/0,01 бромфеноловый голубой). Определенные объемы проб были подвергнуты электрофорезу в 12,5 ДСН-ПААГ и последующему пропитыванию в течение 60 мин в 10 объемах смеси уксусная кислота-метанол-вода (103060), гель пропитывали в(.), согласно инструкциям производителей, высушивали и экспонировали при -70 С с рентгеновской пленкой. Белки, меченые путем использования 35-метионина определяли только длянаправления, причем самый крупный составлял около 45 кб. В том случае, когда- фрагмент исследовали после клонирования в - сайты(с целью образования 7472), то экспрессия данного 45 кб белка все еще отмечалась. Эффект экспрессии активности, ответственной за превращение глифосата в АМРА, на толерантность к глифосату .первоначально определяли путем наблюдения за ростом рекомбинантов в среде, содержащие ингибирующие концентрации глифосата. В тесте сравнивали рост .101, содержащей контрольный вектор (118 и ,1987) или 118 клоны фрагмента 2,5 кб( 74691,4). Показана очень четкая корреляция между способностью утилизировать глифосат и толерантность к глифосату. Этот толерантный фе 10 нотип (устойчивость к 15 мМ глифосата) был затем использован для выполнения быстрого скрининга фенотипов клонов делеций, таких как 7470(- 1,8 кб в 118 образуемых из 74691 путем делеции 700 нп - фрагмента) и последующих клонов. Нуклеотидная последовательность структуры гена глифосат оксидоредуктазы Нуклеотидную последовательность фрагмента (ПОС 3) определяли, используя одноцепочечные ДНК матрицы (полученные в результате использования фагомидных клонов и хелпер М 13 фага 408) и имеющийся в продаже(Международные биотехнологии,.) набор. В результате компьютерного анализа последовательности (ПОС 3) обнаружена единственная большая рамка открытого считывания(РОС) в направлении отк , которая представлена на фиг. 2 и включает участки некоторых из родственных сайтов рестрикции. Предполагаемый стоп кодонлокализуется в положении 2 нп 5 сайтарестрикции. Данные, подтверждающие,чтокодон является кодоном терминации 45 кд РОС, получены следующим образом предварительно были определены 3 пределы, основываясь на фенотипе, способном к утилизации глифосата,которые должны находиться междусайтом 95 нп против течения с сайта) исайтом. В том случае, если - фрагмент клонировали в- сайты, и в условиях экспрессии белковбелок 45 кд продолжал синтезироваться. - фрагмент затем вновь был клонирован из этого .клона в качестве- в 118 -, в результате чего была подтверждена резистентность к 15 мМ глифосату для .101 трансформатов. Согласно этим данным, С-конец 45 кд белка локализуется междуисайтами. Единственный стоп кодон, в любой рамке считывания, между этими сайтами находится непосредственно против течениясайта. Два вышеупомянутых кодона ( расположенный в положениях 120 и 186) при использовании в качествебудут обеспечивать образование белков 46140 и 44002 кд, соответственно, но не будут предшествовать хорошо распознаваемой ШайнДальграно последовательности. Стартовая точка белка была установлена более точно следующим образом последовательности узнаваниясайта рестрикции были введены в положения против течения двух потенциальных стар 12660 товых кодонов путем сайт-направленного мутагенеза 7470, замещениемдля последовательностей( 120) и( 186), 21 и 9 нп против течения 120 и 186,соответственно. За исключением, где отмечено, олигонуклеотидные праймеры для мутагенеза включали последовательности, которые характеризовались измененным фланкированием 8-10 гомологичными основаниями на каждой стороне. Для мутированных клонов определяли толерантность к глифосату. Введениесайта против течения 120 не оказывало влияния на толерантность к глифосату, в то время как она устранялась посредством мутагенеза,обусловленным введениемсайта против течения 186. Эффекты этих мутагенезов на 45 кд белок изучали путем субклонирования мутируемых последовательностей в Т 7 вектора экспрессии, используя сайт в полилинкере 7470 , как раз против течения исходного сайта , и по течениюсайта. Этот сложный фрагмент был вновь клонирован в 11837 (ФАРМАЦИЯ) Кр- и тестирован, как описано выше. 45 кд белок продолжал экспрессироваться при сравнимых уровнях с каждой измутагенной последовательности. Если новыесайты были использованы в качестве 5 концов (и по течениюсайт) для клонирования в .- сайты, то 45 кд белок все еще экспрессировался, когда новыйсайт против течения 120 служил в качестве 5 конца, но не тот,который локализовался против течения 186 являлся 5 концом. Эти данные в значительной степени предполагают, что 120 (или сам кодон локализуется вплотную к нему) является -терминальным концом белка глифосат оксидоредуктазы.сайт,вводимый против течения 186 не приводит к образованию преждевременно законченного или высоко нестабильного белка, и предполагает, что предсказуемые изменения кодирующей последовательности, как результат этого мутагенеза (181918-19) влияли на активность фермента. Дальнейшие данные по подтверждению локализации -конца были получены путем раздельного введения (путем мутагенеза 7470), последовательности узнаваниясайта рестрикции( дляизменения второго кодона от серина к аланину) илипоследовательности( для ) в 120 и экспрессия данной ОРС при использовании эффективных .векторов экспрессии. Ниже дается характеристикаэкспрессии - фрагмент, начинающийся в предполагаемом , клонировали в 2123 (-), замещая 1 слитый фрагмент ( с соавт., 1988). Полученный клон вводили в .101 и клетки подвергали индукции в присутствии налидиксовой кислоты, согласно описанию в течение 2 час ( с соавт., 1988). Полученный белок отличался по размеру от 45 кд белка на ДСН-ПААГ, а клеточный лизат из индуцируемой культуры обладал специфической активностью глифосат оксидоредуктазы, равной 12,8 нмоль АМРА/мин.мг. При выполнении сравнений в отдельном эксперименте, не было выявлено различий для глифосат оксидоредуктазной активности,если второй кодон был представлен аланином вместо серина. Структурная ДНК последовательность для глифосат оксидоредуктазного фермента (ПОС 4) начинается в нуклеотиде 120 и оканчивается в нуклеотиде 1415 - фрагмента фиг. 2, а глифосат оксидоредуктазны й фермент состоит из 431 аминокислоты (ПОС 5). Конструкция векторов трансформации растительного гена глифосат оксидоредуктазы Для оптимизации конструкции структурного глифосат оксидоредуктазного гена внутренние последовательности узнавания сайтов рестрикциииудаляли путем сайт направленного мутагенеза, чтобы заместить последовательностьнаина ,соответственно. Глифосат оксидоредуктазная кодирующая последовательность, подходящая для введения в векторы трансформации растений и их экспрессии, образуется следющим образом-конец соединяется сиделетируемой, кодирующей последовательностью, и Сконец делетируется ксайту, используя на ряде клонирующих этапов интернальныеисайты рестрикции. На этих этапахсайт располагался непосредственно против течениясайта,аисайты были локализованы непосредственно по течению от стоп кодона. Последовательность этого, подвергавшегося манипуляциям,глифосат оксидоредуктазного гена (ПОС 6) представлена на фиг. 3. Подвергнутый манипуляциям глифосат оксидоредуктазный ген еще способен кодировать белок глифосат оксидоредуктазы дикого типа. Манипуляции не изменяют аминокислотный состав последовательности глифосат оксидоредуктазы. Эта структурная последовательность глифосат оксидоредуктазы (ПОС 6) в качестве/-/фрагмента 1321 нп, легко клонируется в соответствующую кассету экспрессии растения. Этот глифосат оксидоредуктазный ген(ПОС 6) клонировали в качестве фрагмента в вектор трансформации и экспрессии растений 979 для образования 17073. Модификация и повторный синтез последовательности гена глифосат оксидоредуктазы Глифосат оксидоредуктазный ген изсодержит последовательности, которые могут обуславливать неблагоприятный эффект на степень экспрессии этого гена в растении. Эти последовательности включают потенциальные сайты полиаденилирования, которые часто обогащены АТ, более высоким, чем показатели, обнаруживаемые в генах 11 12660 растений ( 56 против 50 ), сконцентрированные полосыи С остатков, и кодоны, которые часто не используются в генах растений. Высокая величинав гене глифосат оксидоредуктазы имеет ряд потенцильных последствий, включающих следующие более высокое использованиеили С, по сравнению с тем, которое показано для растительных генов в третьем положении в кодонах, и возможность для образования крепких, типа шпилек,структур, которые могут оказывать влияние на экспрессию и стабильность РНК. Уменьшениесодержания в гене глифосат оксидоредуктазы, обрыв полоси С, исчезновение потенциальных последовательностей полиаденилирования и оптимизация использовния кодона, который более часто используется в генах растений, могут привести к более высокой экспрессии глифосат оксидоредуктазы в растениях. В первой фазе эксперимента выбранные области гена были модифицированы путем сайт направленного мутагенеза. Эти модификации направлены,прежде всего, но не исключительно, на снижениеи на разрушение некоторых изскоплений. Подвергнутый манипуляциям ген глифосат оксидоредуктазы был вначале реклонирован в фагомидный вектор 7258 в качестве фрагмента для образования 17014. Единственная цепочка ДНК была приготовлена из.штамма. Семь участков гена были модифицированы при помощи сайт-направленного мутагенеза с использованием представленных в табл. 4 праймеров и набора мутагенеза(каталог 170-3576) и благодаря протоколам, представленным этим набором. Для ясности представлено обратное дополнение истинных праймеров. Положение нуклеотидов в последовательности, представленной на фиг. 2 и 3,соответствующее праймерам, показаны первым и вторым набором чисел, соответственно. Таблица 4 Праймеры для модификации кодирующей последовательности оксидоредуктазного гена Праймер 1 (149-210 38-99)(31) Праймер 6 (1179-1246 1068-1135)(32) Праймер 7 (1247-1315 1136-1204)(33) Сходство полученного гена (ПОС 7) с контрольным, подвергавшимся манипуляциям, геном глифосат оксидоредуктазы подтверждалось характером его нуклеотидной последовательности, а также его способностью обеспечивать сравнимые с контрольным геном уровни толерантности к глифосату. Данный модифицированный ген (ПОС 7) обозначен как ген модифицированной глифосат оксидоредуктазы.глифосат оксидоредуктазного гена (ПОС 6) снижен с, примерно,56 ,характерных для варианта с манипулированием, приблизительно до 52 в модифицированном случае (ПОС 7). Сравнение гена, полученного в результате манипуляций, и гена глифосат оксидоредуктазы, как модифицированного варианта, показаны на фиг. 3, причем первый вариант представлен наверху, а изменения, полученные в результате модификации - внизу. Данный модифицированный глифосат оксидоредуктазный ген клонирован в качестве - фрагмента в кассету экспрессии растения, включающую - 35 промотор и 3 последовательность. Далее кассету клонировали в качествефрагмента в 886 вектор для образования 17032 (фиг. 5). Синтетический глифост оксидоредуктазный ген(ПОС 8) необходим для обеспечения, насколько возможно, тех ненужных последовательностей,которые обсуждались выше. В качестве резюме,генная последовательность была реконструирована с целью устранения, насколько возможно, следующих последовательностей или отдельных признаков последовательностей (в то же время избегая введения не совсем обязательных сайтов рестрикции) протяженностии С остатков 5 или больше области,обогащенные АТ (преимущественно), которые могут выполнять функцию сайтов полиаденилирования или область потенциальной дестабилизации РНК, а также кодоны, которые не столь часто обнаруживаются в растительных генах. Сравнение генов глифосат оксидоредутазы, полученного в результате манипуляций (ПОС 6), и синтетического (ПОС 8) показано на фиг. 4, причем манипулированный ген (ПОС 6) представлен наверху, а различия,обусловленные синтетическим геном (ПОС 8) - внизу.для синтетического глифосат оксидоредуктазного гена составляет 51 и потенциально обеспечивает быстрое выделение большого количества энергии, причем шпилеобразные структуры в значительной степени редуцированы. 12660 Данный синтетический ген клонировали в качестве- фрагмента в 979 с целью образования 17056 для введения в растения. Экспрессия хлоропласт направляемой глифосат оксидоредуктазы Мишень глифосата в растении, фермент 5 енолпирувилшикимат-3-фосфат синтаза ,локализуется в хлоропласте. Несмотря на то, что глифосат оксидоредуктазная активность, локализованная в цитоплазме, уменьшает или препятствует поступлению глифосата в хлоропласт в трансгенном растении, направление фермента глифосат оксидоредуктазы непосредственно в хлоропласт, согласно данным, ведет к дальнейшему уменьшению эффектов глифосата в отношениисинтазы. Многие локализованные в хлоропластах белки экспрессируются с ядерных генов в качестве предшественников и направляются в хлоропласт посредством хлоропласт транзитного пептида (ХТП), который выделяется в течение нужной стадии. Примрами таких хлоропластных белков являются малая субъединица 5-енолпирувилшикимат-3-фосфат синтаза , ферредоксин, ферредоксин оксидоредуктаза, светособирающий комплексный белоки белок , а также тиоредоксин .ибыло показано, что нехлоропластные белки могут также быть мишенью для хлоропластов посредством белковых слияний с ХТП, и что ХТП последовательность вполне достаточна, чтобы белок стал мишенью для хлоропласта (- с соавт., 1987). Глифосат оксидоредуктазный белок становится мишенью для хлоропласта в результате образования соединения между С-концом ХТП и -концом глифосат оксидоредуктазы. В первом примере был использован специфический ХТП, полученный из МСЕ 1 А гена от( с соавт.,1988). Этот ХТП (обозначен как ХТП 1) был образован путем комбинации сайт-направленного мутагенеза. ХТП 1 структура (ПОС 9) (фиг. 6) включает МСЕ 1 А ХТП (аминокислоты 1-55), первые 23 аминокислоты зрелой МСЕ 1 А белка (аминокислоты 56-78), остаток серина (аминокислота 79), новый сегмент, который повторяет аминокислоты от 50 до 56 из МСЕ 1 А ХТП и первые две аминокислоты из зрелого белка (аминокислоты 80-87), а также аланиновый и метиониновый остатки (аминокислоты 88 и 89).сайт рестрикции локализуется на 3 конце(захватываеткодон) с целью обеспечения конструкции более точного слияния с 5 глифосат оксидоредуктазы или других генов. На более поздней стадии,сайт вводится против теченияконца МСЕ 1 А последовательности, чтобы способствовать встраиванию слияния в трансформирующий вектор растения. Слияние было осуществлено между ХТП 1(ПОС 9) и манипулированной глифосат оксидоредуктазой (ПОС 6) (посредством 1 сайта) в 3 векторе с целью образования 17034. Данный вектор может быть транскрибированс использованием 6 полимеразы и с последующей РНК трансляцией с участием 35 метионина, что обеспечит получение материала,который можно вводить в хлоропласты, изолированные из, применяя описанные ниже методы (- с соавт., 1986, 1987). Вместе с тем было найдено, что данное ХТП 1-глифосатоксидоредуктазное слияние характеризуется 9 эффективностью поступления в хлоропласты по сравнению с контролем, 35 меченым Пре(6140 - с соавт., 1986). Далее была получена конструкция ХТП 1-глифосат оксидоредуктазного слияния с синтетическим глифосат оксидоредуктазным геном (ПОС 8), которая вводилась в качестве - фрагмента в растительный вектор 979 с целью образования 17066 (фиг. 7). После промежуточного этапа клонирования для приобретения большего числа сайтов клонирования, ХТП 1-глифосат оксидоредуктазное слияние также было подвергнуто клонированию в качестве - сайта в 981 для образования 17138 (фиг. 8). Во втором примере ХТП-глифосат оксидоредуктазное слияние было образовано между( с соавт., 1987) ХТП и синтетичесими глифосат оксидоредуктазными кодирующими последовательностями. ВначалеХТП был получен путем сайт-направленного мутагенеза,чтобы встроить сайт рестрикции 1 в ХТП сайт процессинга. В результате этого мутагенеза в данной локализации замещается на -. Последовательность этого ХТП, обозначенная как ХТП 2 (ПОС 10), представлена на фиг. 9.сайт синтетического глифосат оксидоредуктазного гена (ПОС 8) был замещен на 1 сайт, который перекрываеткодон. Второй кодон был превращен в кодон лейцина на этой же стадии. Данное изменение не имело явного эффекта на активностьглифосат оксидоредуктазы в . . ХТП 2 синтетическое глифосат оксидоредуктазное слияние клонировали ви полученную матрицу транскрибировали, используя Т 7 полимеразу, и синтезированный 35-метионинмеченый материал, согласно данным, импортировался в хлоропласты с эффективностью, сходной с эффективностью ХТП 1-глифосат оксидоредуктазного слияния. ХТП 2-синтетическое глифосат-оксидоредуктазное слияние затем клонировали в качестве- фрагмента в растительный вектор экспрессии для образования 17164. Структурная карта данной плазмиды представлена на фиг. 12. Часть растительного вектора 17164 (фиг. 12) включает следующие фрагменты. Химерный ген резистентности к канамицину, полученный путем генной инженерии для экспрессии в растении, обеспечивает отбор трансформированной ткани. Химерный ген состоит из 35 промотора вируса мозаики цветной капусты 0,35 кб (-35) ( с соавт.,1985), 0,83 кб гена неомицин фосфотрансферазы 13 12660 типаи 0,26 кб 3-нетранслируемой области гена нопалин синтазы ( 3) ( с соавт.,1983) 0,45 кбвфрагменте из 15955 октопинплазмиды, которая содержит Т-ДНК левую пограничную область ( с соавт., 1983) 0,75 кб фрагмент, содержащий ориджин репликации из 2 плазмиды (-) ( с соавт., 1981) 3,0 кбвсегменте 322, обеспечивающих ориджин репликации для поддержания .(322) исайт для конъюгационного переноса в клетки. 0,93 кб фрагмент,изолированный из транспозона 7, который кодирует резистентность бактерий к спектиномицин/стрептомицину (с/) ( с соавт., 1985), и является селективным фактором для . и. 0,36 кбфрагменте из 37 плазмиды, которая содержит нопалин-тип Т-ДНК правую пограничную область( с соавт., 1985). Кассета экспрессии, включающая 0,6 кб 35 промотор из вируса мозаики норичника шишковатого (-) ( с соавт.,1989), несколько уникальных сайтов клонирования,и 0,7 кб 3 нетранслируемую область гена -9 гороха (Е 9 3) ( с соаст., 1984 с соавт., 1985). Фрагмент ХТП 2-синтетического глифосат оксидоредуктазного слияния был клонирован в упомянутую кассету экспрессии. В приведенных ниже примерах описаны введение этой плазмидыи последующая трансформация растения. Специалисты поймут, что можно получать различные химерные конструкции, где используется функция специфического ТП для сопряженного импортирования фермента глифосат оксидоредуктазы в хлоропласты растительных клеток. Поступление глифосат оксидоредуктазы в хлоропласт можно протестировать посредством следующей пробы. Проба на поглощение хлоропластом Интактные хлоропласты изолируют из латука(вар. ) путем центрифугирования в Перкол) Фикол градиентах согласно модификациис соавт. (1982). Полученный осадок интактных хлоропластов суспензируется в 0,5 мл стерильного 330 мМ сорбитола в 50 мМ -,рН 7,7, исследуют на содержание хлорофилла(, 1949) и доводят конечную концентрацию хлорофилла в растворе до 4 мг/мл, добавляя сорбитол/. Выход интактных хлоропластов из одной головки латука составляет 3-6 мг хлорофилла. Обычный тест на поглощение с объемом 300 мкл включает 5 мМ АТФ, 8,3 мМ немеченного метионина, 322 мМ сорбитола, 58,3 мМ -КОН (рН 8,0),50 мкл продуктов трансляции лизата ретикулоцитов,и интактные хлоропласты из . (200 мкг хлорофилла). Смесь поглощения слегка покачивали при комнатной температуре (в 10 х 75 мм стеклянных пробирках) непосредственно перед оптическим осветительным прибором при максимальной интенсив 14 ности освещения (лампочка 150 вт). Кратные пробы смеси поглощения (около 50 мкл) брали через разные периоды времени и фракционировали 100 мкл силикон-масляного градиента (в 150 мкл полиэтиленовых пробирках) путем центрифугирования при 11000 хв течение 30 мин. При этих условиях интактные хлоропласты образуют осадок в нижней части силикон-масляного слоя, а инкубационная среда (содержащая лизат ретикулоцитов) всплывает на поверхность. После центрифугирования пробы силикон-масляных градиентов немедленно замораживаются в сухом льду. Далее осадок хлоропластов ресуспензируется в 50-100 мкл лизисного буфера(10 мМ -КОН рН 7,5, 1 мМ РМ, 1 мМ бензамидина, 5 мМ -аминокапроновой кислоты, и 30 мкг/мл апротинина) и подвергается центрифугированию при 15000 хв течение 20 мин для получения осадка тилакоидных мембран. Прозрачный супернатант (белки стромы) этого центрифугата и объем инкубационной среды лизата ретикулоцитов из каждого теста поглощения смешиваются с равным объемом 2 Х ДСН-ПААГ простого буфера для электрофореза (см. ниже). ДСН-ПААГ-метод выполняли в соответствии с(1970) в 3-17(вес/объем) акриламидных гелях на пластинах (60 х 1,5 мм) с 3(вес/объем) акриламидными концентрирующими гелями (5 х 1,5 мм). Гель фиксировали в течение 20-30 мин в смеси из 40 метанола и 10 уксусной кислоты. Затем гель вымачивали в течение 20-30 мин в 3 ( ), после чего его высушивали в аппарате для высушивания гелей. Гель просматривали путем авторадиографии, используя интенсифицирующий экран и экспонирование в течение ночи,чтобы определить, поступила ли глифосат оксидоредуктаза в изолированные хлоропласты. Альтернативный протокол изолирования для других структурных генов глифосат оксидоредуктазы Были выполнены интенсификация и клонирование ряда других глифосат оксидоредуктазных генов,включая второйглифосат оксидоредуктазный ген из космидной класса 7477. Ген локализован, согласно Соузерн гибридизации, на 23 кбфрагменте, рассматривавшемся в вышеуказанном разделе клонирования, с использованием первого глифосат оксидоредуктазного гена в качестве пробы. Посредством Соузерн анализа также выявленыиполосы гибридизции 3,5 и 2,5 кб, соответственно.фрагмент из 7477 был субклонирован всайтвектора. Клон в . 101 (7482), в котором клонируемый фрагмент ориентирован относительнопромотора как в 74691, был индуцирован си испытан на глифосат оксидоредуктазную активность. В данном эксперименте специфическая активность составляла около 93 нмоль/мин.мг. В последующем эксперименте, класс 12660 и класскосмиды также были изолированы после заражения . 101 тем же самым препаратом упакованных космид и отбора непосредственно на толерантность к глифосату при 3-5 мМ глифосата в М 9 среде. Глифосат оксидоредуктазный ген также был субклонирован из другого микробного изолята, первоначально идентифицированного по его способности осуществлять утилизацию глифосата в качестве источника фосфора и, как показано позднее, содержащего предполагаемый глифосат оксидоредуктазный ген, судя по результатам гибридизации с пробойглифосат оксидоредуктазного гена. Этот ген вначале клонирован в космиду Т 7 промотора с использованием скрининга на толерантность к глифосату в . 101/1-2 ( и , 1969 и , 1985) на М 9 среде, содержащей глифосат в концентрации 3 мМ. Наличие глифосат оксидоредуктазного гена было впервые показано положительным сигналом гибридизации сгеном и путем его локализации на 2,5 кбфрагменте. Этотфрагмент клонировали всайт в(17183) и осуществляли экспрессию отпромотора в результате добавления . В данном эксперименте была получена глифосат оксидоредуктаза со специфической активностью 53 нмоль/мин.мг, что подтверждает изолирование гена данным методом. Эти глифосат оксидоредуктазные гены обычно обладают следующими чертами гены находятся (показано путем Соузерн гибридизации с использованием проб гена глифосат оксидоредуктазы полной длины) на 2,5 кбфрагментах, на 3,5 фрагментах,содержат одинсайт в пределах гена и не включаютсайт. Следующая диаграмма иллюстрирует некоторые общие черты этих генов-кодирующая область Высокая степень сходства глифосат оксидоредуктазных генов также предполагает возможность другого пути клонирования новых глифосат оксидоредуктазных генов. Очевидное сохранение областей,фланкирующих гены и отсутствие определенных сайтов рестрикции указывает на использование одноцепочечных олигонуклеотидных проб для фланкирующих областей, содержащих сайты рестрикции для , , , , , или других подходящих сайтов клонирования, и ПЦР (полимерная цепочечная реакция см. , 1989, для более детальной информации о ПЦР и ее применении) с целью амплификации фрагмента глифосат оксидоредуктазного гена, удобного для клонирования. На фиг. 2 представлены фланкирующие последовательности для 119 н.п. против течения (ПОС 11) гена глифосат оксидоредуктазы дикого типа ( изолята) и для 290 н.п. (ПОС 12) по течению гена. В результате использования подхода с применением ПЦР был изолирован целый ряд глифосат оксидоредуктазных генов из различных источников. Наличие глифосат оксидоредуктазной активности подтверждалось клонированием глифосат оксидоредуктазного гена из хромосомальной ДНК, полученной из. Штамма( с соавт.,1988) и использованием праймеров, гомологичных- и С-концамглифосат оксидоредуктазного гена, а также содержанием следующих подходящих рестрикционных сайтов клонирования 5-3 (13) и 5-3 (14) (ПОС 14). Ниже даны циклотермические параметры, используемые в этих ПЦР денатурация при 94 С в течение 1 мин отжиг при 60 С в течение 2 мин полимеризация при 72 С в течение 3 мин 30 циклов, без самоудлинения, линкированных при инкубации при 4 С. Образованный в результате ПЦР 1,3 кб фрагмент был подвергнут расщеплениюии затем клонирован в 2123 для экспрессии кодируемого фермента. Активность глифосат оксидоредуктазы измеряли, как описано выше, и К для глифосата было сходно с соответствующей величиной для ферментов из , представленных выше. Источник глифосата ген оксидоредуктазы. Штамм Бактерии, изолированные в ходе процессов с использованием глифосата в установках по обработке отбросов, также могут обладать способностью превращать глифосат в АМРА. В качестве двух подобных примеров можно назватьштаммыи. Такого типа бактерии могут быть использованы такжеиз этих очистительных установок. Популяция бактерий была изолирована из стационарной колонки иммобилизации клеток, которая была заполнена частичками-635 диатомовой земли, путем помещения на Триптон Сойя Агар (Дифко), содержащий циклогексимид в концентрации 100 мкг/мл, и инкубации при 28 С. Черз колонку в течение трех месяцев пропускали воду с примесями с, ,завода по производству глифосата. Колонка содержала 50 мг/мл глифосата и 3 в качестве 4. Общий органический углерод составлял 300 мг/мл и БПК (биологическая потребность в кислороде - мера мягкого наличия углерода) была менее 30 мг/мл. Такая колонка по обработке была описанас соавт. (1990). Один из наиболее предпочтительных штаммов данной популяции, идентифицированный как. штамм Т 10, был обнаружен 15 12660 при росте минимальном бульоне, где основным источником углерода был глифосат в концентрации 10 мМ (этот бульон готовили длясреды, но включающей глифосат, который заменяет глюкозу,глюконат и цитрат). Хромосомальную ДНК готовили из этого изолята и подвергали той же самой ПЦР процедуре и с теми же самыми праймерами, которые выше описаны для штамма . После получения фрагмента нужного размера его клонировали в вектор экспресии Определяли активность глифосат оксидоредуктазы, а также К для глифосата Источник гена как. штамм Т 10 О превращении глифосата в АМРА сообщалось для многих разных почв (см.с соавт., 1989 для обзора) и имеется целый ряд методов для экстракции общей ДНК из смешанных проб, взятых из окружающей среды, таких как почва ( с соавт., 1988 и , 1988 и , 1991),что указывает на возможность клонирования глифосат оксидоредуктазных генов в отсутствии первого изолята, такого как разрушающийся микроорганизм. Конечно, процедура, описанная для клонирования глифосат оксидоредуктазных генов, основанная на обеспечении способности утилизации глифосата или толерантности к глифосату, на примере ., дает схему, по которой можно клонировать другие глифосат оксидоредуктазные гены или гены, метаболизирующие глифосат, не считаясь с гомологией, указанной для описанных выше глифосат оксидоредуктазных генов. Возможно также обогащение расщепляющих глифосат бактерий, например, путем повторного использования глифосата в партии почвы( с соавт., 1988 с соавт., 1984). Эта обогащающая стадия может быть использована для повышения легкости извлечения генов глифосат оксидоредуктазы из почвы или других источников окружающей среды. Указания на присутствие глифосат оксидоредуктазного гена у почвенных бактерий и процедура для выделения таких генов заклюаются в следующем популяция подходящих бактерий обогащается путем отбора бактерий, способных расти на жидкой среде с добавлением глифосата (при 10 мМ) в качестве источника углерода (эта среда готовится согласно описанию для - среды, но с изъятием источника углерода и св качестве источника Р). Материал для заражения был взят из экстракта почвы (с недавно убранного поля, засеянного соей, в Джерсивилле, Иллинойс), и популяция была подвергнута отбору путем успешного культивирования в описанной выше среде при 28 С (для предотвращения грибкового роста в среду добавляли циклогексимид в концентрации 100 мкг/мл). При помещении на среду с -агаром, были идентифицированы 5 типов колоний. Хромосомальную ДНК готовили из 2 мл культуры в -бульоне этих изолятов, и наличие 16 глифосат оксидоредуктазного гена определяли, используя ПЦР скрининг. Используя праймеры(ПОС 15) и(ПОС 16), был получен фрагмент ДНК заданного размера с хромосомальной ДНК из одного из изолятов (обозначен 3). Примененные ПЦР условия были следующие 1 мин при 94 С 2 мин при 40 С 3 мин при 72 С 35 циклов. Фрагмент ДНК, полученный таким путем, используется в качестве пробы(после изотопного мечения) для изолирования 3 глифосат оксидоредуктазного гена, кандидата из космидного банка, сконструированного, как описано дляДНК, причем данный фрагмент облегчает изолирование других глифосат оксидоредуктазных генов. Используемые праймеры гомологичны внутренним последовательностям вглифосат оксидоредуктазном гене. Примененные условия ПЦР допускают определенную степень несоответствия в праймерах, и в результате предполагается, что глифосат оксидоредуктазный ген из 3 необязательно является близкородственным геном к другим генам глифосат оксидоредуктазы, которые были успешно изолированы при использовании праймеров к - и С-концамгена. Для изолирования генов известно большое разнообразие методов. Некоторые из этих процедур основаны на данных о функции генов, что позволяет планировать фенотипический скрининг для целей изолирования генов. Другие методы основаны, по крайней мере, на частичной информации о последовательности ДНК, в связи с чем возможно использование проб и праймеров с частичной или полной гомологией, или методы, которые основаны на использовании антител для обнаружения генных продуктов. Каждый из вышеуказанных вариантов может быть применен для клонирования генов глифосат оксидоредуктазы. Оптимизация кинетических свойств глифосат оксидоредуктазы Предшествующие примеры гербицидной резистентности, достигнутой путем ферментативной инактивации гербицидов, используют ферменты,которые способны связывать и метаболизировать гербициды гораздо более эффективней, чем глифосат оксидоредуктаза метаболизирует глифосат. Фермент глифосат оксидоредуктаза имеет К для глифосата 20-30 мМ, и как результат, скорость реакции рсщепления глифосата можно повысить с оптимальной эффективностью в трансгенных растениях или путем снижения К или повышения . Техника рандомного мутагенеза в сочетании с соответствующими отбором и скринингом является прекрасным инструментом, который можно успешно использовать для получения больших количеств измененных генных последовательностей и потенциальных вариантов. Те же самые подходы можно использовать для изолирования и идентификации 12660 глифосат оксидоредуктазных вариантов с повышенной эффективностью расщепления глифосата. К приемлемым методам мутагенеза относятся химический мутагенез бактериальных культур, содержащих нужный ген или очищенную ДНК этого гена, а также ПЦР методы, используемые для получения копий гена (или частей его) в условиях, которые благоприятны для неправильного включения нуклеотидов (ошибки) в новую цепочку. Примером такого условия может быть выполнение ПЦР реакции в присутствии М. Соответствующий скринингдля получения улучшенных вариантов после мутагенеза может быть также использован для повышения толерантности к глифосату у Е.или повышенного роста в присутствии глифосата уштаммов. С целью скрининга, ген глифосат оксидоредуктазы клонируется в векторе, содержащем слабый бактериальный промотор и/или в репликоне с небольшим числом копий. Фенотипы, толерантные к глифосату, различных глифосат оксидоредуктазных конструкций,как показано, варьируют в отношении концентраций глифосата, а также коррелируют с уровнем экспрессии глифосат оксидоредуктазы. Например, в условиях отсутствия индукции, Р-глифосат оксидоредуктазные векторы экспрессируют более низкие уровни глифосат оксидоредуктазы, чем -глифоат окидоредуктазные векторы, и также проявляют более низкую толерантность к глифосату. Генный фрагмент после мутагенеза клонируют в более подходящий вектор и подвергают скринингу полученную библиотеку. Варианты отбираются по их способности расти в присутствии определенных уровней глифосата, которые подавляют рост контрольного штамма, содержащего родительский клон глифосат оксидоредуктазы. Активность глифосат оксидоредуктазы обеспечивает Е.пособность превращать глифосат в АМРА, и, в подходящих штаммах Е.этот АМРА может служить источником фосфата вследствие расщепления С-Р связи при помощи С-Р лиазы. Подходящими штаммами Е. с являются В штаммы илипроизводные К штаммов. Ген глифосат оксидоредуктазы обеспечивает минимальный рост на глифосате, как единственном источнике фосфора в штамме .101(В 993). Согласно данным, скорость роста на глифосате также коррелируетуровнем экспрессии глифосат окидоредуктазы. Полученный в результате мутагенеза глифосат оксидоредуктазный ген клонируют в соответствующий вектор и библиотеку вариантов скринируют путем различной скорости роста в чашках или при культивировании в среде,содержащей глифосат, в качестве единственного источника фосфора. Клоны, которые показывают более интенсивный рост на чашках по сравнению с контрольным штаммом, вновь подвергаются скринированию путем анализа кривой роста. Варианты глифосат оксидоредуктазы, идентифицированные при каждом отборе/скрининге, клонируют в вектор с высоким уровнем экспрессии и под вергают ферментативному анализу для определения К ивеличин для глифосата. Наилучшие варианты глифосат оксидоредуктазы подвергают очистке для полной кинетической характеристики. Варианты глифосат оксидоредуктазы, которые характеризовались более низкими величинами К и сходными или более высокими величинамипо сравнению с соответствующими величинами фермента дикого типа, подвергались анализу путем секвенирования нуклеиновых кислот для определения мутации (или мутаций). Основная цель процедуры заключается в изолировании вариантов с более высоким отношением / для расщепления глифосата, катализируемого глифосат оксидоредуктазой. Изолирован вариант улучшенной модификации такого типа. Процедура мутагенеза состояла из ПЦР с применением , и матрица представляла собой линейную плазмиду с глифосат оксидоредуктазным геном, содержащую синтетический глифосат окидоредуктазный ген (ПОС 8). Олигонуклеотидные праймеры были гомологичнымиобластями вектора и фланкирующими ген глифосат окидоредуктазы. ПЦР выполняли в следующих условиях 1 мин при 94 С, 2 мин при 55 С и 3 мин при 72 С, с 35 циклами. Использовали отношение дЦТФдГФТТФ к дТФ, равное 51. Реакции включали 2 при 125, 250, 375 или 500 мк. После реакции амплифицированный продукт вновь подвергался клонированию в вектор, содержащий слабый промотор Е. со. Этот вектор является производным 327, включающим апромотор и подходящие сайты клонирования. Сто колоний с данной стадии клонирования были затем скринированы в . 993 с целью отбора на повышенную толерантность к глифосату и фенотипов утилизации в среде, состоящей изминимальной среды с глифосатом иили с одним глифосатом, соответственно. Скорости роста определяли путем измерения А 550 в течение 96-часового периода. При данном скрининге были идентифицированы три клона, характеризующиеся наиболее интенсивной скоростью роста. Эти трансформанты обладали фенотипом,способность к утилизации которого была в 1,5-2,0 раза выше. Ген глифосат оксидоредуктазы был вновь клонирован в часть вектора экспрессии, после чего была выполнена верификация этого фенотипа. Весь кинетический анализ проводили на интактных лизатах Е. . Предполагаемые белковые варианты глифосат оксидоредуктазы были подвергнуты дополнительной экспрессии после субклонирования варианта гена / глифосат оксидоредуктазы в Р-ген 10 вектор экспрессии. Для дополнительной экспрессии в РА-ген 10 конструкциях,993 клетки, содержащие вектор, были индуцированы при Клетт 110-120 в М 9 минимальной среде с 50 мкг/мл налидиксовой кислоты и инкубированы в течение 2,5 часов при 37 С при сильном встряхивании. Клетки затем собирали путем центрифугирования при 4000 в течение 5 мин при 4 С и ресуспензировали в 100 м Трис-, рН 7,1, 1 мМ ЭДТК,17 12660 35 мМ , 20 глицерина, и 1 мМ бензамидина в 3 мл/г клеточного осадка. Лизаты готовили путем разрушения клеток в Френч Прессе, дважды подвергая давлению в 1000( фунтов на квадратный дюйм). Нерастворимый остаток удаляли путем центрифугирования при 12000 , в течение 15 мин при 4 С, и супернатант подвергали обессоливанию путем пропускания через Р-10 колонку (Сефадекс 25, Фармацея). Выделенная фракция была использована в качестве источника фермента для кинетического анализа. Концентрацию белка определяли путем использовании Био-Ред связывающей краситель белковой пробы. Для определения линейных пределов выполняли тестирование в разное время и с разными концентрациями. Проба на фермент заключалась в следущем лизат и глифосат оксидоредуктазную смесь (конечная концентрация 0,1 М МОР,0,01 М Трицина, рН 7,4, 0,01 м , 10 мМ 2) в 100 мкл реакционной смеси предварительно инкубировали при 30 С в течение 2 мин перед добавлением глифосата (аналитический маточный раствор готовили в воде, рН которой доводили до 7,0, используя ОН). 10 минут являются оптимальным временем для тестирования фермента с использованием 10 мкг лизата. После 10 мин инкубации при 30 С при постоянном встряхивании добавляли 0,25 мл динитрофенилгидразина (ДНФГ) (0,5 мг/мл в 0,5 М ), и затем реакцию проводили ещ дополнительных 5 мин при 30 С при постоянном встряхивании. После этого к тестируемой смеси добавляли 1,5 М раствор(400 мкл), и снова реакция проходила в течение 5 мин при 30 С при встряхивании. Активность фермента определяли исходя из количества образованного продукта глифосат - ДНФГ путем измерения 520 по отношению к стандарту глифосата. Тестирование ферментов осуществляли дважды, по крайней мере, на двух изолятах одной колонии предполагаемого варианта глифосат оксидоредуктазы. Для определения К и, тестирование фермента выполняли с использованием (0,2-2,0) хпредела концентраций глифосата. К иопределяли согласно, - и гиперболических кинетических кривых.устанавливали после определения количества иммунореактивного глифосат оксидоредуктазного белка в лизатах иммуноблот анализа, опи санного ниже. Иммуноблот анализ выполняли после ДСН-ПААГ и переноса белкагеля на нитроцеллюлозу при 500 мА в аппарате Хоффера в 25 мМ Трис/, 192 мМ глицине, содержащем 0,1 ДСН и 25 метанола, в течение 1-2 часов. После переноса нитроцеллюлозу инкубировали с 50 мМ Трис, рН 7,5, 0,9, 0,01 Твин 20, 0,023, содержащего 2 бычьего сывороточного альбумина, при комнатной температуре при встряхивании в течение, по крайней мере, 30 мин. После слипания добавляли тот же самый буфер, содержащий 125000 разведение козлиной анти-глифосат оксидоредуктазной антисыворотки, и помещали на фильтр при встряхивании при комнатной температуре в течение 45 мин. После инкубации с первичными глифосат оксидоредуктазными антителами,фильтр промывали в течение 45 мин в буфере, не содержащем антител затем добавляли буфер, содержащий 15000 разведение кроличьих антикозлиная щелочная фосфотаза - коньюгированных вторичных антител (от Пирса), и фильтр инкубировали в течение 45 мин при комнатной температуре и встряхивании. После чего фильтр промывали в буфере без антител в течение 30 мин, перед тем, как добавитьи(Р) с целью окрашивания. Определяли также количество иммунореактивного глифосат оксидоредуктазного белка путем дот блоттинга лизата на нитроцеллюлозе и последующей обработки фильтра, как описано выше, за исключением того, что для обнаружения был использован 125-Белок . Количество глифосат оксидоредуктазного белка в лизатах определяли путем подсчета метки и сравнения радиоактивности со стандартным белком глифосат оксидоредуктазы. Один из вариантов показал (вар. 247) 3-4-кратное увеличение специфической активности глифосат оксидоредуктазы при наличии 25 м глифосата, а результаты иммуноблот анализа свидетельствовали в пользу того, что этот факт не был связан с повышением уровня белка глифосат оксидоредуктазы. Последующее тестирование показало, что данный вариант характеризовался величинойдля глифосата, которая была в 10 раз ниже, чем в случае глифосат оксидоредуктазы дикого типа. Сходным образом определяли величинудля . Эти данные представлены ниже. Кинетический анализ вариантов глифосат оксидоредуктазы Вариант Дикий тип Вар. 247 Ген глифосат оксидоредуктазы из вар. 247 был секвенирован (ПОС 17), в результате чего было обнаружено пять изменений в нуклеотидах. Поскольку эти изменения связаны с кодонами, то они здесь указанына(кодон 43), отсутствие изменений в аминокислотахна(кодон 18 84), Сер на Глина(кодон 153), Лиз на Арг САС на(кодон 334), Гис на Арг ССА на(кодон 362), без изменений в аминокислотах. Аминокислотная последовательность глифосат оксидоредуктазного гена из в. 247 представлена в качестве ПОС 18. Важность этих различных из 12660 менений в аминокислотах исходно оценивается путем повторного клонирования измененных участков в глифосат оксидоредуктазу дикого типа и определения эффекта на активность и кинетику глифосат оксидоредуктазы. Это осуществляется путем реклонирования - фрагмента (содержит кодон 84),- фрагмента (содержит кодон 153) и Ара- фрагмента (содержит кодон 334), по отдельности, в ген дикого типа. Эти гены глифосат оксидоредуктазы были экспрессированы, после чего был выполнен кинетический анализ. Представленные ниже данные показывают, что изменение, происшедшее в - фрагменте (содержит кодон 334) ответственно исключительно за изменение в ферменте. Кинетический анализ изменений доменов Клон Эти результаты подтверждаются и дополняются в результате повторного изменения Гис на Арг в кодоне 334 и введением в этот остаток других специфических изменений путем сайт-направленного мутагенеза. Далее перечислены использованные праймеры Арг -Т (ПОС 19) Лиз -(ПОС 20) Глю (ПОС 21) Ала -(ПОС 22) (эти последова тельности являются антисмысловыми в отношении к последовательностям, используемым в настоящее время). Наличие этих изменений подтверждается секвенированием генов глифосат оксидоредуктазы после мутагенеза. Выполнен кинетический анализ экспрессируемых ферментов глифосат оксидоредуктазы, данные которого показывают, что ряд замен возможен в данном положении, и это, в свою очередь, приводит к синтезу фермента с измененными кинетическими свойствами. Кинетический анализ вариантов глифосат оксидоредуктазы Вариант Дикий тип В. 247 Арг 334 Лиз 334 Глн 334 Ала 334 Дополнительный мутагенез был осуществлен для замены Хиз 334 остатка на другой аминокислотный остаток. Для выполнения этой процедуры использовали следующие праймеры и новый кодон(эти последовательности являются антисмысловыми в отношении последовательностей, используемых в настоящее время эти праймеры также присоединяют молчащий , который облегчает идентификацию в популяции потомков, полученных в результате мутагенеза). 334 вариант сохраняет значительную активность глифосат оксидоредуктазы, в то время как 334, 334 и 334 варианты обнаруживают значительно более низкую активность. Из вариантов первой генерации, варианты с более высоким отношением / предпочтительно 19 12660 подвергаются второму циклу мутагенеза, который сопровождается последующим скринингом и анализом. Альтернативный подход может заключаться в получении второй генерации вариантов глифосат оксидоредуктазы путем комбинации точечных мутаций, идентифицированных среди вариантов первой генерации. Трансформация растений Используя данное изобретение, можно обеспечить толерантность к глифосату у следующих видов растений, однако, следует ответить, что данный список не является исключительным соя культурная,хлопок, зерновые, лен, подсолнечник, картофель,табак, томат, пшеница, рис, люцерна, латук, яблоня,тополь, сосна, сахарная свекла, репс, канола. Двухцепочечная молекула ДНК изобретения(химерный ген) может быть встроена в геном растения путем использования подходящего метода. Удобными векторами для трансформации растений являются векторы, полученные изплазмиды, а также обнаруженные,например, -(1983),(1984), (1985), и представленные в ЕРО публикации 120516 ( с соавт.). Кроме векторов трансформации растений, производныхили рутиндуцирующих плазмид ( ) , могут быть использованы альтернативные методы для встраивания конструкций ДНК изобретения в растительные клетки. К таким методам можно, например,отнести использование липосом, электропорации,химических веществ, повышающих степень поглощения свободной ДНК, поступление свободной ДНК посредством микропроектирующего бомбардирующего устройства, или трансформацию, использующую вирусы или пыльцу. р 979 вектор трансформации/экспрессии растений получен из р 886 (описан ниже) путем замещения гена неомицин фосфотрансферазы типа(КА) в рМ 886 0,89 кб фрагментом, содержащим бактериальный ген гентамицин-3-ацетилтрансферазы типа(ААС(3)-) ( с соавт., 1988). Химерный -35/(3)-/ 3 гн кодирует резистентность к гентамицину, что обеспечивает отбор трансформированных растительных клеток. рМО 979 также содержит 0,95 кб кассету экспрессии, состоящую из усиленного 35 промотора ( с соавт., 1987), нескольких уникальных сайтов рестрикции и 3 конца (Р-Е 35/3). Остальные рМ 979 ДНК сегменты являются точно такими же, как в 886. Плазмида 886 построена из следующих сегментов ДНК. Первый представлен 0,93 кбв соединении с Есо фрагментом, изолированным из транспозона Т 7, кодирующим бактериальную резистентность к спектиномицин/стрептомицину(/), таким образом, являясь детерминантой для отбора у Е. и. Данный сегмент соединяется с 1,61 кб фрагментом ДНК,20 кодирующим химерную канамицин резистентность,что обеспечивает отбор трансформированных растительных клеток. Химерный ген (Р-35/КА/3) содержит 35 промотор вируа (Са) мозаики цветной капусты, ген неомицин фосфотрансферазы типа(КА) и 3-нетранслируемую область гена нопалин синтазы ( 3) ( с оавт., 1983). Следующий сегмент представлен 0,75 кб , содержащим ориджин репликации из К 2 плазмиды. Он соединяется с 3,1 кбв соединении ссегментом из рВ 322 ( 322), обеспечивающим поддержание ориджина репликации в Е. , а такжесайт для коньюгационного переноса в клетки. ледующий сегмент является 0,36 кбв соединении сиз рТТ 37,который несет нопалин-тип Т-ДНК правого края( с соавт., 1985). 98 плазмида содержит следующие сегменты ДНК 0,93 кб фрагмент, изолированный из транспозона Т 7 и кодирующий бактериальную резистентность к спектиномицин/стрептомицину/ детерминанта для отбора в Е.и( с соавт., 1985) химерный ген резистентности к канамицину, полученный путем генной инженерии для экспрессии в растении, что обеспечивает выбор трансформированной ткани, включающий 0,35 кб промотор 35 вируса мозаики цветной капусты (Р-35) (соавт., 1985), 0,83 кб ген неомицин фосфотрансферазы типа(КА) и 0,26 кб 3-нетранслируемую область гена нопалин синтазы ( 3) ( с соавт., 1983) 0,75 кб ориджин репликации из К 2 плазмиды( с соавт., 1981) 3,1 кбв соединении ссегмент из 322, который обеспечивает ориджин репликации для поддержания в Е. со (-322)сайт для коньюгационного переноса в клетки, а также 0,36 кбв соединениифрагмент из плазмиды рТТ 37, включающий правую краевую область нопалин-тип Т-ДНК (соавт., 1985). Кассета экспрессии состоит из 0,6 кб 35 промотора из вируса мозаики норичника шишковатого (Р-)( с соавт., 1989) и 0,7 кб 3-нетранслируемую область -9 гена гороха (9 3) ( с соавт.,1984 М с соавт., 1985). 0,6 кбфрагмент,содержащий 35 промотор (фиг. 1), был сконструирован инженерным путем для помещения подходящих сайтов клонирования по течению транскрипционного стартового сайта. Вектор растения используется вштамме.штамм является А 208, несущей бесплечнуюплазмиду рТС 58 (90) ( и , 1986). Т плазмида не обладает генами Т-ДНК фитогормонов, и поэтому штамм не способен вызывать корневой рак. Сочетание вектора растения сдостигается посредством системы трипарентальной конъюгации, использующейплазмиду 2013(соавт., 1980). В том случае, если ткань растения инкубируют с коньюгатом вектор расте 12660 ния, то вектор переносится в клетки растения в результатефункций, кодируемых бесплечной рТС 58 плазмидой. Вектор открывает правую краевую область Т-ДНК, и полная последовательность вектора ратения может быть встроена в хромосому растения хозяина. рТС 58 Т плазмида не переносится в клетки растения, а остается в . Регенерация растений Когда в трансформированных клетках или протопластах достигается необходимая активность глифосат оксидоредуктазы, то клетки (или протопласты) регенерируют в целые растения. Методы, используемые на этапе регенерации, являются не столь исключительными в каждом конкретном случае,причем подходящие прописи имеются для растений из(люцерна, соя культурная, клевер), (морковь, сельдерей, пастернак), (капуста, редис, рапс и т. д.),С (дыни и огурцы),(пшеница,рис, кукуруза и т. д.),(картофель, табак,томат, перец) и различных цветковых культур. См.,например, , 1984 , 1989, 1990 , 1990. Ниже приведены примеры, более детально знакомящие с использованием изобретения, однако для их интерпретации вовсе необязательно ограничиваться только рамками настоящего изобретения. Специалисты поймут, что представленные здесь методы и описанные гены можно, соответствующим образом, модифицировать или сократить, однако при этом не затрагивая самой сути изобретения. Примеры Экспрессия, активность и фенотип глифосат оксидоредуктазы в трансформированных растениях В следующих примерах описаны трансформация,экспрессия и активность глифосат оксидоредуктазы,а также толерантные к глифосату фенотипы, полученные у растений с помощью оксидоредуктазных генов, введенных в.и/или. , используя векторы 17073, 17032, 17065, 17066,17138 и 17164. Согласно исходным данным, полученным для табака, экспрессия гена глифосат оксидоредуктазы, полученного в результате манипуляций (ПОС 6), под контролем Е 35 промотора (см. данные по 17073 в табл. 8 и 9, в качестве примера) характеризуется низкими уровнями. Транскрипция гена была подтверждена у 3-4 растений путем Нозерн ианализа, однако не был обнаружен белок глифосат окидоредуктазы (предел обнаружения в данной пробе сотавлял около 0,01 уровня экспрессии). Анализ о растений после опрыскивания 0,4 фунтов/акр (примерно, 0,448 кг/га) глифосата также свидетельствовал об очень незначительных уровнях толерантности. Модификация генной последовательности (описанная в данном сообщении) привела к усилению экспрессии в растениях табака, в результате использованияпромотора и слияния ХТП с глифосат оксидоредуктазным геном. В этом случае, большая часть данных получена на трансгенных растениях, трансформированных с помощью векторов, содержащих вышеуказанные оптимизированные конструкции глифосат оксидоредуктазы. Одна из серий экспериментов с модифицированным глифосат оксидоредуктазным вектором р 17032 описана в примере 1. Пример 2 представляет результаты исследований глифосат оксидоредуктазы,полученной в результате манипуляций, синтетической глифосат оксидоредуктазы, а также ХТП 1 синтетической глифосат оксидоредуктазы. Трансформация и экспрессия глифосат оксидоредуктазы у канолы описаны в примере 3. Пример 1 Протокол трансформации листовых дисков табака представляет ткань нормальных листьев в возрасте около 1 месяца. После 15-20-минутной стерилизации поверхности 10 Клороксом в сочетании с поверхностно-активным веществом листья трижды промывали в стерильной воде. Используя стерильный бумажный пуансон, листья пробивали и помещали вверх дном в 104 среду (М соли - 4,3 г/л,сахароза - 30 г/л, витамины В 5 - 500 Х 2 мл/л, АА 0,1 мг/л и ВА - 1,0 мг/л) с целью преинкубации в течение одного дня. Затем диски заражали ночной культурой бесплечной, содержащей нужный вектор, причем культура была разведена 1/5 (т. е. около 0,6 ОД - оптическая плотность). Заражение осуществляли путем помещения дисков в центрифужные пробирки с культурой. По прошествии 3060 секунд жидкость отсасывали, а диски промокали с помощью стерильных бумажных фильтров. Затем диски помещали вверх дном в чашки с питательной средой 104 на фильтры для сокультивирования. Через 2-3 дня сокльтививния диски переносили, опять же вверх дном, в чашки для селекции со средой 104. Через 2-3 недели образовавшийся каллюс или отдельные побеги были отделены от листовых дисков. Побеги отрезали от каллюса, когда они становились уже достаточно большими и их можно было отличить от стеблей. Отобранные побеги помещали на свободную от гормонов среду, благоприятную для роста корней (М соли 4,3 г/л, сахароза - 30 г/л и В 5 витамины - 500 Х 2 мл/л). Через 1-2 недели образовывались корни. Любое тестирование листового каллюса предпочтительно выполнялось на корневых побегах, сохранявших стерильность. Корневые побеги помещали в почву и содержали в условиях повышенной влажности (т. е. в пластических контейнерах или сумках). Корни все более укоренялись в результате поддержания влажности в окружающей среде. Всего было исследовано 45 резистентных к канамицину 17032 линий табака (табл. 5). 21 12660 Таблица 5 Экспрессия модифицированного глифосат оксидоредуктазного гена в растениях табакарастения трансгенные варианты рМО 17032 использование глифосата в новых каллюсах вестерн анализ растений Листья, вновь образующие каллюсы в среде с тканевой культурой растения, обнаруживали низкий уровень толерантности к глифосату (определяется как /- фенотип), по крайней мере, в 11 из исследованных линий. Не менее 24 линий показывали обнаруживаемый уровень экспрессии глифосат оксидоредуктазы в пределах от 0,5 до 2 нг на 50 мкг экстрагируемого белка. Толерантность к глифосату, обнаруженная при тестировании листьев с вновь образованным каллюсом, и более высокий уровень экспрессии глифосат оксидоредуктазы, свидетельствуют в пользу того, что изменения в кодирующих гллифосат оксидоредуктазу последовательностях,обусловленные конструированием модифицированного глифосат оксидоредуктазного гена (ПОС 7), оказали заметный эффект на способность этого гена экспрессироваться в растениях. Тот же самый эффект может быть достигнут в результате экс прессии гена глифосат оксидоредуктазы, полученного с помощью манипуляций (ПОС 6) при применении сильных промоторов растений, путем использования лучших последовательностей 3 сигнала полиаденилирования, оптимизации последовательностей рядом с кодоном инициации для нагружения рибосом и инициации трансляции, или же путем комбинаций этих или других регуляторных или экспрессирующих последовательностей или факторов. 1 потомки ряда из указанных линий, включая тех,которые обнаруживали наиболее высокий уровень экспрессии глифосат оксидоредуктазы ( 18854 и 18848), были подвергнуты опрыскиванию глифосатом в объеме 0,4 и 1,0 фунтов на акр (0,448 и 1,12 кг/га, соответственно), после чего в течение 4 недельного периода производили оценку вегетативных признаков (табл. 6). Таблица 6 Данные опрыскивания табака для рМ 17032 растений Линия После исходнойфазы эти линии обнаруживали вегетативную толерантность к глифосату при обоих режимах опрыскивания (которая со временем повышалась), причем особенно это касалось растений, характеризовавшихся наиболее высокими 22 уровнями экспрессии глифосат оксидоредуктазы. Активность фермента глифосат оксидоредуктазы определяли у двух из РМО 17032 линий ( 18858 и 18881). Ткань листьев (1 г) замораживали в жидком азоте и хранили вплоть до приготовления экс 12660 тракта при -80 С. С целью экстракции ткань листьев измельчали в ступке и растирали пестиком с жидким азотом. К распыленной в порошок ткани листьев добавляли 1 мл экстрагирующего буфера(100 м ТрисС 1, рН 7,4, 1 мМ ЭДТК, 20 глицерин, 35 мМ , 1 мМ бензамидин , 5 мМ аскорбата , 5 мМ дитиотреитола, и 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 4 С), после чего пробу перетирали в течение 1 мин. Полученную смесь центрифугировали в течение 5 мин (высокая скорость, ) и супернатант обрабатывали насыщенным раствором сульфата аммония для получения 70 конечного насыщения (2,33 мл насыщенный раствор/мл экстракта). Осажденный белок собирали, как указано выше, путем центрифугирования, и осадок ресуспензировали в 0,4 мл экстрагирующего буфера. После центрифугирования пробуцелью удаления частиц подвергали обессоливанию,пропуская через сефадекс 50, содержавшийся в 1 мл шприце и уравновешенном экстрагирующим буфером, в соответствии с методом(1979). Обессоленные растительные экстракты сохранялись на льду, и белковые концентрации определялись методом(1976). Реакции на глифосат оксидоредуктазу выполняли в дублированных пробах в течение 60 мин при 30 С в смеси 0,1 /0,01 трицинового буфера, рН 7,4, содержащим 10 м 2, 0,01 мМ флавин аденин динуклеотида (,Сигма), и 1 мМ кофермента(Сигма). Растительные экстракты (75 мкл) предварительно инкубировали в вышеуказанной смеси в течение 2 мин, после чего осуществляли инициацию реакций путем до бавления иминоацетоуксусной кислоты (ИАУК,20 мкл) в качестве субстрата до конечной концентрации 50 мМ (общий объем пробы - 0,2 мл). Реакционные смеси охлаждали и подвергали дериватизации, как описано ниже. Контрольные реакции выполняли в отсутствии ИАУК и растительного экстракта. Определение глиоксилата осуществляли путем использования 2,4-динитрофенилгидразин (2,4 ДНФГ) дериватизации и фазообращенной высоко эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ),используя модификацию методас соавт.(0,5 мг/мл ДНФГв 0,5 М ) и подвергали дериватизации в течение 5 мин при 25 С. После этого пробы экстрагировали этилацетатом (2 х 0,3 мл) и комбинированные этилацетатные экстракты экстрагировали 1023 (0,3 мл). 23 фазу затем однократно отмывали этилацетатом(0,2 мл) и 23 фазу вводили (100 мкл) вС 18 ВЭЖХ колонку (5 мк,4,6 мм х 25 см), используябинарную ВЭЖХ систему с 990 фотодиодным / ВЭЖХ детектором, с помощьюВЭЖХ аутоинъектора. Изократическая мобильная фаза представлена смесью метанол-вода-уксусная кислота (6038,51,5) с 5 мМ тетрабутиламмонийфосфата(Пирс). ДНФГ - глиоксилатный пик (время задержки 6,7 мин) обнаружен в пределах 365 нм. Выполнено сравнение этого пика со стандартом глиоксилата (Сигма, 20 мкм в 0,2 мл), подвергнутым дериватизации точно таким же образом. Таблица 7 Активность глифосат оксидоредуктазы в трансгенных растениях табака Растение Пример 2 Серия трансформированных линий табака была получена в результате использования изогенных глифосат оксидоредуктазных векторов рМО 17073(глифосат оксидоредуктаза, полученная путем манипуляций) (ПОС 6), р 17065 (синтетическая глифосат оксидоредуктаза) (ПОС 8), и р 17066 (ХТП 1-синтетическая глифосат оксидо Специфическая активность, нмоль/мин мг 0 (не обнаружено) 0,039 0,018 редуктаза). Путем Вестерн анализа ряда из этих линий (табл. 7) показано, что растения с манипулированной глифосат оксидоредуктазой экспрессируют до 0,5 нг глифосат оксидоредуктазы на 50 мкг растительного белка, с синтетической глифосат оксидоредуктазой - до 0,5-2 нг на 50 мкг и с ХТП 1 синтетической глифосат оксидредуктазой - от 2 до 20 нг на 50 мкг белка. Экспрессия глифосат оксидоредуктазы в растениях табака Конструкция 17073 (манипулированная) Шкала Вестерн оценки на 50 мкг белка 0 - не обнаружено глифосат оксидоредуктазы 1 - 5 нг 2 - .5 нг - 2 нг 3 - 2 нг. Ряд линий первичных трансформантов , экспрессирующих манипулированную или синтетическую глифосат оксидоредуктазу, или ХТП 1 синтетическую глифосат оксидоредуктазу, были об работаны глифосатом в концентрации 0,4 фунтов/акр (0,448 кг/га), после чего была выполнена оценка, как описано выше. Данные обработки глифосатом 17066 (ХТП 1-глифосат оксидоредуктаза) табака ( растения) Объем обработки,фунт/акр (кг/га)0,4 фунт/акр(0,448 кг/га) линия Вестерн оценка Контроль А 0 Контроль В 0 Контрль С 0 22933 1 22741 2 22810 3 22825 1 22822 3 22844 3 22854 3 22860 3 22880 1 22881 2 22886 3 22887 3 Шкала Вестерн оценки (на 50 мкг белка) 0 - не обнаружено глифосат оксидоредуктазы 1 - 0,5 нг 2 - 0,5-2 нг 3 - 2 нг.Вегетативный признак 0 - мертвые 10 - эффект не обнаружен. дни после обработки Не обнаружена глифосат оксидоредуктаза 12660 Линия с синтетической глифосат оксидоредуктазой обнаруживала ответ, сходный с ответом, который наблюдали у растений 1 модифицированной глифосат оксидоредуктазой, характеризовавшихся некоторыми непосредственными эффектами глифосата, которые со временем исчезали в результате метаболизирования гербицида глифосат оксидоредуктазой на производные АА и глиоксилат. Поскольку мишень глифосата (ЕР синтаза) локализуется в хлоропласте, активность глифосат оксидоредуктазы должна приводить к снижению уровня глифосата в данной органелле в результате удаления гербицида прежде его попадания в хлоропласт. Растения с ХТП 1-синтетической глифосат оксидоредуктазой обнаруживали повышенную толерантность к глифосату, которая проявлялась в том, что глифосат не оказывал на эти растения какого-либо эффекта при данной концентрации обработки. Обычно обработанные толерантные растения характеризовались нормальным развитием, цветением и плодородием. ХТП 1-синтетические глифосат оксидоредуктазные растения показывали заметно более высокий уровень экспрессии глифосат оксидоредуктазы по сравнению с другими глифосат оксидоредуктазными конструкциями. Этот повышенный уровень глифосат оксидоредуктазы может быть обусловлен увеличением трансляции конструкции, представленной слиянием или выделением фосфат оксидоредуктазы внутри хлоропласта, что, в свою очередь, приводит к более длительному периоду полувыведения белка. Белее высокий уровень глифосат оксидоредуктазы и/или е локализация в хлоропласте могут быть причиной более высоких уровней толерантности к глифосату благодаря быстрому разрушению глифосата в хлоропласте. Наличие глифосат оксидоредуктазы в пределах хлоропласта установлено. Пять листьев от каждого из четырех растений ( 22844,22854, 22886, 22887), которые, по данным Вестерн анализа, оказались положительными на глифосат оксидоредуктазу, подвергали гомогенизации всмесителе в 0,9 буфер ( с соавт.,1982) в течение 3 х 3 сек при высокой скорости. Гомогенат фильтровали через 4 слояи центрифугировали при 6000 об/мин в -3 роторе. Осадок ресуспензировали в 4 мл смеси буфер и наслаивали на 40/80 ступенчатый градиент,после чего центрифугировали при 9500 об/мин в течение 10 мин. Интактные хлоропласты (нижняя полоса) однократно промывали -буфером ( с соавт., 1982) и центрифугировали при скорости до 6000 об/мин без торможения. Затем их подвергали ресуспензированию в 300 мкл 50 мМрН 7,7,330 мМ орбитола и последующему лизированию на льду при помощи ультразвука (малая проба, 30 -3 отстаивание в микропипетках х 10 сек). После осаждения остатков супернатант пропускали через колонку с сефадексом 50 в 50 мМ , рН 7,5. Концентрация растворенного белка составляла 2,4 мг/мл. Тестирование фермента проводили, как указано выше, используя как 50 мМ ИАУК, так и 50 мМ глифосат в качестве субстратов (30 мин пробы), но без добавления 1 мМ кофактора . Таблица 9 Активность глифосат оксидоредуктазы в изолированных хлоропластах трансгенного табака Субстрат Иминоацетоуксусная кислота Глифосат Пример 3 Ряд трансформированных линий канолы получены с использованием векторов рМО 17138 (ХТП 1 синтетическая глифосат оксидоредуктаза) и 17164 (ХТП 2-синтетическая глифосат оксидоредуктаза) следующим образом. Материал растений Сеянцыбыли высажены в 2 дюймовые (5 см) горшки, содержащие 350. Растения росли в ростовой камере при 24 С, 16/8-часовом фотопериоде, световой интенсивности 400 -2 сек-1 ( лампы). Среда обогащалась, применяя 20-10-20. Через 2 1/2 недели их пересаживали в 6 дюймовые (15 см) сосуды и оставляли расти в камере при 15/10 С день/ночь температуре, при 16/8 часовом фотопериоде, световой интенсивности 800 -2 сек-1 (Н лампы). Среда обогащалась применением 15-30-15. Трансформация/Отбор/Регенерация Четыре терминальных междоузлия удалялись из растений непосредственно перед выходом в стрелку или в ходе этого процесса, но обязательно перед цветением, и поверхность их подвергалась стерилизации в 70 объем/объем этаноле в течение 1 мин,2 вес/объем гипохлорита натрия в течение 20 мин,после чего они трижды промывались стерильной деионизированной водой. Стебли с листьями могут быть заморожены во влажных пластиковых сумках вплоть до 72 час перед стерилизацией. От 6 до 7 отрезков стебля были нарезаны на 5 мм диски при помощи 200, обеспечивающего ориентацию базального конца.выращивают примерно сутки в ротаторе при 24 С в 2 мл бульона Луриа, содержа 25 12660 щего 50 мг/л канамицина, 24 мг/л хлорамфеникола и 100 мг/л спектиномицина. Готовят 110 разбавление в М ( и ) среде, что дает примерно 9 х 108 клеток на мл. Это подтверждено показателем оптической плотности при 660. Кружки стебля (экспланты) инокулируют 1 мл , избыток с эксплантов отсасывают. Экспланты помещают базальной стороной вниз на пластинки Петри, содержащие 1/10 Х стандартных М солей, В 5 витамины, 3 сахарозы, 0,8 агара (рН 5,7), 1 мг/л 6-бензиладенина (БА). На пластинки наносят слой 1,5 мл среды, содержащей М соли, В 5 витамины, 3 сахарозы (рН 5,7), 4 мг/л пхлорфеноксиуксусной кислоты, 0,005 мг/л кинатина и покрывают стерильной фильтровальной бумагой. После 2-3 дней сокультивирования экспланты переносят в глубокие плоские чашки Петри, содержащие М соли, В 5 витамины, 3 сахарозы, 0,8 агара (рН 5,7), 1 мг/л БА, 500 мг/л карбенициллина,50 мг/л цефотаксима, 200 мг/л канамицина или 175 мг/л гентамицина для селекции. На каждую пластинку помещают семь эксплантов. Спустя 3 недели экспланты переносят в свежую среду по 5 эксплантов на пластинку. Экспланты культивируют в ростовой комнате при 25 С и непрерывном освещении (холодный белый свет). Анализ экспрессии Через 3 недели с эксплантов срезают побеги. Для подтверждения модификациипобегов проводят анализ на повторное каллюсообразование в листьях. Три крохотных кусочка ткани листьев помещают на среду повторного каллюсообразования, содержащую М соли, В 5 витамины, 3 сахарозы, 0,8 агара(рН 5,7), 0,5 мг/л нафталинуксусной кислоты (НУК),500 мг/мл карбенициллина, 50 мг/л цефтоксима и 200 мг/л канамицина или гентамицина, или глифосата. Анализируемые листья инкубируют в ростовой комнате в тех же условиях, что культура эксплантов. Спустя 3 недели проводят оценку анализа на повторное каллюсообразование с позицией толерантности к гербициду (каллюс или ткань зеленого листа) или чувствительности (отбеливание). Трансплантация Во время отрезания стебли с побегами помещались ви затем в 2-дюймовую (5 см) сосуды, содержащие - 350 и находящиеся в условиях влажности. Растения помещались в ростовую камеру при 24 С, 16,8-часовом фотопериоде,400 -1 сек-2 ( лампы) примерно на 3 недели с целью укоренения. Семя, собранное от о растения, представляет собой 1 семя, дающее начало 1 растению. Для оценки толерантности к глифосату о растения тестируется его потомство. Поскольку считается, что о растение является гомизиготным в каждом положении вставки, самоопыление приводит к максималь 26 ной генотипической сегрегации в 1. Каждая вставка действует как доминантный аллель, поэтому в отсутствии сцепления и предположении, что только одна гомизиготная вставка требуется для проявления толерантности, одна вставка будет сегрегировать как 31, две вставки как 151, три вставки как 631. В связи с этим, для обнаружения хотя бы одного резистентного фенотипа необходимо выращивать соответственно несколько 1 растений. Семена от о растений собирают, размельчают и высушивают перед посевом для теста опрыскивания глифосатом. Были использованы различные методики выращивания растений для проведения исследований по оценке 1 обработки. Тестирование проводили как в теплицах, так и в ростовых камерах. Использовали две системы посева 10 см горшки или посевные лотки, содержащие 32 или 36 клеток. Применяемая в данном случае почва представляла собой или 350 с добавлением трех типов медленно освобождающегося удобрения, или установку 350. В теплицах орошение производили сверху, а в ростовых камерах использовали субирригацию. Удобрение вносили, сколько требуется, с водой для орошения. Температурный режим соответствовал требованиям, установленным для канолы. Использовали 16-часовой фотопериод. В начале цветения растения переносили в 15 см горшки для образования семян. Партия обработки состояла из нескольких наборов 1, потомков, причем все они обрабатывались в одно и то же время. В состав некоторых партий входили растения, отличные от 1, оценку которых также надо было выполнить. Кроме того, каждая партия включала как обработанные, так и необработанные, нетрансгенные генотипы, представляющие генотипы отдельной партии, которые, предположительно должны быть трансформированы. Кроме того, в партию включают один или более несегрегирующих трансформированных генотипов, предварительно идентифицированные, как обладающие определенной резистентностью. От двух до шести растений из каждого отдельного о потомства не обрабатываются и служат в качестве контролей для сравнения и измерения толерантности к глифосату, а также для изучения какихлибо изменений, обусловленных не глифосатом, а другими факторами. Когда остальные растения достигают стадии 2-4 листа, что обычно наблюдается через 10-20 дней после посева, производится обработка глифосатом в концентрациях, варьирующих от 0,28 до 1,12 кг/га, в зависимости от объекта исследования. Была разработана технология низких доз,характеризующаяся малыми объемами гербицида. При лабораторных исследованиях дозы опрыскивания колибруются таким образом, чтобы получить концентрации, эквивалентные таковым в полевых условиях. Для оценки обработанных растений на вегетативную резистентность используется шкала от 0 до 10. Шкала относится и к необработанным растениям 12660 от одного и того же о растения. 0 - означает гибель растения, в то время как 10 является показателем отсутствия каких-либо видимых отличий от необработанного растения. Числа между 0 и 10 отражают постепенное снижение степени поражения растений при сравнении с вообще необработанными особями. Оценка растений производится на 7, 14 и 28 дни после обработки (ДПО) или в период выхода стрелки, причем линия характеризуется средней оценкой обработанных растений в пределах семейства растений . Шесть целых чисел используются для качественного описания репродуктивных нарушений, обусловленных глифосатом 0 отсутствие развития цветочной почки 2 цветочные почки имеются, однако останавливаются в развитии перед раскрытием 4 цветы раскрыты, но без пыльников или же пыльники не способны вытянуться за пределы лепестков 6 стерильные пыльники 8 частичная стерильность пыльников 10 полная фертильность цветков. Оценка растений с использованием данной шкалы проводится вначале или вскоре после начала цветения, в зависимости от скорости развития структуры цветка. Табл. 10 и 11 представляют оценки вегетативных и репродуктивных характеристик для растений канолы, трансформированных с применением, соответственно, р 17138 (обработаны в концентрации 0,56 кг/га) и рМО 17164 (обработаны в концентрации 0,84 кг/га). Приведенные результаты показывают, что растения канолы приобретают толерантность к глифосату в результате экспрессии в растениях гена глифосат оксидоредуктазы. Таблица 10 Оценка обработки глифосатом растений канолы, содержащих 17138 Таблица 11 Оценка обработки глифосатом растений канолы, содержащих 17164 Конструкция Пример 4 Ген глифосат оксидоредуктазы также вводили в растения сои обыкновенной, где он экспрессировался, в результате чего эти растения приобретали толерантность к глифосату. Ген слияния ХТП 2 синтетической глифосат оксидоредуктазы (описанный выше) вводили в растения сои обыкновенной в условияхпромотора и с 3 последовательностями в векторе рМО 17159, карта которого представлена на фиг. 10. Кроме последовательностей глифосат оксидоредуктазного гена данный вектор включает следующие элементыориджин репликации, РТ 11 бактериальный селективный маркерный ген (канамицина) и ген бетаглюкуронидазы (с оавт., 1986) под контролем 35 промотора и с Е 9 3 последовательностями. Последний ген обеспечивает маркер оценки для облегчения идентификации трансформированного материала растений. Трансформация растений сои обыкновенной выполняетсяиспользованием рМО 17159 посредством метода микропроектирующих инъекций с применением технологии нацеленного бомбардирования частицами, описаннойсоавт. (1988). Семена, собранные отрастений, обозначаются как 1 семенами, которые дают начало 1 растениям. Для оценки толерантности к глифосату о растения оценивается потомство этих растений. Посколькурастение считается гмизиготным в каждом положении вставки, то самоопыление приводит к максимальной генотипической сегрегации в 1. Так как каждая вставк функционирует как доминантный аллель, то в отсутствии сцепления и предположении,что только одна гмизиготная вставка необходима для экспрессии толерантности, одна вставка будет сегрегировать как 31, две вставки как 151, три вставки как 631 и т. д. Поэтому для обнаружения хотя бы одного резистентного фенотипа необходимо выращивать, соответственно, несколько 1 растений. Семена отрастений сои обыкновенной собирают и высушивают перед посевом для теста обработки глифосатом. Семена высаживают в 4 дюймовые (5 см) квадратные горшки, содержащие 350. Для тестирования считается достаточным количество в 20 саженцев от каждого о растения. Растения содержатся и развиваются в условиях, характерных для теплицы. Обычно поддерживаются 12,5-14-часовой фотопериод и температура 30 С днем и 24 С ночью. При необходимости, среда обогащаетсяудобрением, растворимым в воде. Партия обработки включает несколько наборов 1 потомков, которые опрыскиваются в одно и то же время. Некоторые партии могут также включать отличные от 1 растения с целью их оценки. В каждой партии также имеются обработанные и необработанные нетрансгенные генотипы, представляющие генотипы отдельной партии, которые предположительно являются трансформированными. Кроме того, партия содержит один или более несегрегирующих, трансформированных генотипов, предварительно идентифицированных как обладающие определенной резистентностью. Одно или два растения от каждого отдельного о потомка не обрабатываются и служат в качестве контроля для сравнения и характеристики толерантности к глифосату, а также для исследования какойлибо изменчивости, обусловленной не глифосатом, а иными факторами. Когда остальные растения достигают первой трехлистной стадии, что обычно наблюдается через 2-3 недели после посадки, производится обработка глифосатом в концентрации 128 унций на акр (8,895 кг/га) . При лабораторных исследованиях дозы обработки колибруются таким образом, чтобы получить концентрации, эквивалентные таковым в полевых условиях. Использованы вегетативные оценки от 0 до 10. Оценка относится и к необработанным потомкам от одного и того же растения. 0 означает гибель растения, в то время как 10 - отсутствие явных отличий от необработанного растения. Числа между 0 и 10 отражают постепенное снижение степени поражения растений при сравнении с необработанными особями. Оценка растений производится на 7, 14 и 28 дни после обработки (ДПО). 12660 Таблица 12 Оценка обработки глифосатом растений сои обыкновенной, содержащих рМО 17159 Линия 17159-24 17159-25 17159-28 17159-40 17159-43 17159-71 17159-77 17159-81 Необработанные Пример 5 Ген глифосат оксидоредуктазы также вводили в клетки зерен пшеницыс экспрессией белка, определяемого в каллюсе. Плазмида рМО 19632 была использована для введения гена глифосат оксидоредуктазы в клетки зерен. Основа этой плазмиды образована путем встраивания 35 промотора РНК (35) 0,6 кб вируса мозаики цветной капусты (СаМ), содержащего дупликацию -90 и -300 области ( с соавт., 1987). 0,58 кб фрагмента, содержащего первый интрон гена алкоголь дегидрогеназы (соавт., 1987), 3 терминальных последовательностей из гена нопалин синтазы( с соавт., 1983) в р 119(- с соавт., 1985). рМО 19632 была образована путем встраивания 1,7 кб / фрагмента из р 17064, содержащей 9 ТП в соединении с последовательностью, кодирующей синтетическую глифосат оксидоредуктазу(ПОС 8). Плазмиду рМО 19632 вводили вклетки зерен путем метода совместной бомбардировки с ЕС 9, плазмидой, содержащей устойчивую к сульфонилмочевине форму гена ацетолактатсинтазы кукурузы. 2,5 мкг каждой плазмиды были наслоены на вольфрамовые частицы и введены вклетки в логарифмической фазе, используя метод бомбардировки Р-1000 частиц, описанный в своей основе у с соавт., 1939. Трансфоманты селектировали насреде, содержащей 20 частей на миллиард хлорсульфорона. После первичного отбора на хлорсульфорон, каллюсы были исследованы посредством Вестерн блот глифосат оксидоредуктазы.каллюс (3 г влажного веса) высушивали на бумажном фильтре (Ватман 1) под вакуумом,вновь взвешивали и добавляли экстрагирующий буфер (500 мкл/г сухого веса 100 мМ трис, 1 мМ ЭДТК, 10 глицерина). Ткань гомогенизировали с помощьюподвесной мешалки в течение 30 сек при 2,8 мощности установки. После центрифугирования (3 мин, ), супернатант удаляли и подсчитывали количество белка (проба на белок). Пробы наносили (50 мкг/лунка) на ДСН ПААГ (, 3-17 ) вместе со стандартом глифосат оксидоредуктазы (10 нг), подвергали электрофорезу,и затем переносили на нитроцеллюлозу, подобно ранее описанному методу (, 1987). Нитроцеллюлозный блот исследовали с применением козлиного антиглифосат оксидоредуктазного иммуноглобулинаи обрабатывали 1-125 Белком . Блот с радиоактивной меткой просматривали путем авторадиографии. Результаты подсчитывали, используя метод денситометрии с применением ЛКБ УльтраСкан Х лазерного денситометра, и представляли в виде табл. 13. Таблица 13 Экспрессия глифосат оксидоредуктазы в каллюсе , использующим 19632 Линия ЕС 9 (без ) Т 13-17 Т 13-16 Т 13-15 Т 13-14 Т 13-14 Т 13-12 Т 13-7 Т 13-5 Т 13-18 Т 13-8 Т 13-9 Т 13-4 12660 Из табл. 13 видно, что глифосат оксидоредуктаза может экспрессироваться и, следовательно, е можно обнаружить в однодольных растениях, таких как пшеница. Пример 6 Ген глифосат оксидоредуктазы можно использовать в качестве селективного маркера трансформации растений непосредственно на среде, содержащей глифосат. Возможность селекции и идентификации трансформированного растительного материала зависит, в большинстве случаев, от использования доминантного селективного маркерного гена для обеспечения возможности предпочтительного и непрерывного роста трансформированных тканей в присутствии ингибирующего в норме вещества. Гены, ответственные за резистентность к антибиотикам и толерантность к гербицидам, были использованы почти исключительно, как доминантные, селективные маркерные гены в присутствии соответствующего антибиотика или гербицида. Наиболее часто, очевидно, используется схема отбора на/канамицин. Было показано, что также пригодна глифосат оксидоредуктаза, которая может быть превосходным селективным маркером в схеме отбора для получения и идентификации трансформированных растений. В данной схеме используется в качестве вектора трансформации растений рМ 17226 (фиг. 11). Эта плазмида напоминает многие другие описанные плазмиды и, в основном, включает предварительно описанную систему репликации бактерий, которая обеспечивает репликацию этой плазмиды в Е. с, а также е введение и репликацию вбактериальный селективный маркерный ген(/), и П 1 глифосат оксидоредуктазный синтетический ген впромотор-Е 9 3 кассете, локализованный между Т-ДК правого края и левым краем. Эта плазмида также обладает отдельными сайтами для ряда ферментов рестрикции, локализованными внутри границ или вне кассеты экспрессии. Это позволяет легко добавлять другие гены или генетические элементы к вектору, который вводится в растение. Представлен протокол прямого отбора трансформированных растений табака на глифосате. Для прекультивирования растения готовили согласно стандартной методике, описанной в примере 1 стерилизация поверхности листьев от растений табака в возрасте 1 месяца (15 мин в 10 хлороксеповерхностно-активное вещество 3 ХН 2 О смывы) растения нарезались на квадраты 0,5 х 0,5 см, с удалением краев листьев, средних жилок, верхушки и концов черешка для получения однородной ткани эксплантаты размещали в один слой, кверху дном на 104 чашках 2 мл 4 С 005 К среды для увлажнения поверхности период прекультивирования составлял 1-2 дня. Эксплантаты заражали используя ночную культуру , содержащую плазмиду трансформации растения, причем титр доводится до 1,2109 бактерий/мл 4 С 005 К среды. Экс 30 плантаты помещали в центрифужную пробирку, куда также добавляется суспензия , и смесь бактерий и эксплантатов подвергается максимальному смешиванию с использованиемв течение 25 сек для полной гарантии проникновения бактерий. Бактерии сливались и эксплантаты размещали между слоями сухой стерильной фильтровальной бумаги для удаления избытка бактерий. После промокания эксплантаты помещали вверх дном в 104 чашки 2 мл 4 С 005 К средыфильтровальный диск. Сокультивирование продолжалось 2-3 дня. Эксплантаты переносили в 104 карбенициллин 1000 мг/лцефотаксим 100 мг/л на 3 дня (фаза задержки). Затем эксплантаты переносили в 104 глифосат 0,05 мМкарбенициллин 1000 мг/лцефотаксим 100 мг/л для фазы отбора. На 4-6 неделе побеги отделяли от каллюса и помещали в МОкарбенициллин 500 мг/л корневую среду. На 3-5 дни образовывались корни,причем в это время из корневых чашек можно брать кусочки листьев для подтверждения толерантности к глифосату, а также трансформации материала. Присутствие белка глифосат оксидоредуктазы в этих трансформированных тканях подтверждалось иммуноблот анализом листовых дисков. Далее представлены данные одного эксперимента с М 17226 25 побегов, образованных на глифосате от 100 эксплантатов, заражали/17226 15 из них оказались положительными в отношении повторного образования каллюса на глифосате, и 19 из них были положительными на белок глифосат оксидоредуктазы, обнаруженный путем иммуноблот анализа. Согласно этим данным,степень трансформации составляла 15-19 на 100 эксплантатов, что свидетельствует о высокой эффективности и экономии времени благодаря процедуре трансформации для растения. Сходные степени трансформации были получены при использовании р 17226, производного (рМ 17241), содержащего ген глифосат оксидоредуктазы в. 247 (ПОС 17). Как было показано, ген глифосат оксидоредуктазы обеспечивает прямой отбор трансформантов в других видах растений, включая ,картофель, сахарную свеклу. Из всего вышесказанного видно, что изобретение позволяет осуществить все цели и задачи, о которых упоминалось ранее, что свидетельствует о преимуществах и ценности данной работы. Понятно, что необязательно использовать все комбинации и характеристики или же применять их безотносительно к другим свойствам изобретения,однако при всех изменениях необходимо учитывать набор требований к использованию изобретения. При учете требований к изобретению возможны,однако, различные варианты его применения, причем необходимо помнить, что приведенные здесь ранее и далее схемы и фигуры надо расценивать только как иллюстративный, а вовсе не ограничивающий материал.

МПК / Метки

МПК: C12N 15/33, C12N 5/10, C12N 9/06, C12N 1/21, C12N 15/82

Метки: клетка, трансформированная, выделенной, двуцепочной, включающий, молекулу, растительная, пептид, бактерий, получения, изолированный, варианты, штамм, днк, трансформированных, генетически, молекула, способ, растений

Код ссылки

<a href="http://kzpatents.com/30-12660-molekula-vydelennojj-dvucepochnojj-dnk-varianty-sposob-polucheniya-geneticheski-transformirovannyh-rastenijj-izolirovannyjj-peptid-varianty-shtamm-bakterijj-vklyuchayushhijj-moleku.html" rel="bookmark" title="База патентов Казахстана">Молекула выделенной двуцепочной днк (варианты), способ получения генетически трансформированных растений, изолированный пептид (варианты), штамм бактерий, включающий молекулу двуцепочной днк, трансформированная растительная клетка</a>

Похожие патенты