Штамм микроорганизма Lactobacillus plantarum AP-1, используемый в качестве нового антибиотикорезистентного и антимутагенного пробиотика

Скачать PDF файл.

Формула / Реферат

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма пробиотических бактерий Lactobacillus plantarum АР-1 и может быть использован в качестве нового антибиотикорезистентного и антимутагенного пробиотика.
Данный штамм отвечает предъявленным требованиям. Штамм проявляет высокую антимутагенную активность, отличается высокой устойчивостью к антибиотикам.
Штамм Lactobacillus plantarum АР-1 проявляет высокую антимутагенную активность к мутагенам НММ и 2-НФ, а также резистентность к антибиотикам офлоксацин (300 мкг/мл) и амоксициллин (150 мкг/мл).

Текст

Смотреть все

(51) 12 1/20 (2010.01) 61 35/74 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма пробиотических бактерийАР-1 и может быть использован в качестве нового антибиотикорезистентного и антимутагенного пробиотика. Данный штамм отвечает предъявленным требованиям. Штамм проявляет высокую антимутагенную активность, отличается высокой устойчивостью к антибиотикам. ШтаммАР-1 проявляет высокую антимутагенную активность к мутагенам НММ и 2-НФ, а также резистентность к антибиотикам офлоксацин (300 мкг/мл) и амоксициллин (150 мкг/мл).(72) Кистаубаева Аида Сериковна Савицкая Ирина Станиславовна Жубанова Ажар Ахметовна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Казахский национальный университет им. аль-Фараби Министерства образования и науки Республики Казахстан-1,ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ НОВОГО АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОГО И АНТИМУТАГЕННОГО ПРОБИОТИКА Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма пробиотических бактерийАР-1 и может быть использован в качестве нового антибиотикорезистентного и антимутагенного пробиотика. Известен штаммР-19,применяемый для производства пробиотика бифицина, применяемого для лечения заболевание желудочно-кишечного тракта животных (Патент РФ 2000117915 А, МПК С 12 1/20, А 61 К 35/74 опубликован 07.10.2002), однако недостатком известного штамма является недостаточно высокая биологическая активность и технологичность. Известен наиболее близкий по техническому результату к заявленному штаммуМЕ-314241. Он используется для приготовления лекарственного продукта для профилактики и лечения кишечных инфекций и уроинфекций,а также применяется для приготовления функциональных пищевых продуктов(Патент РФ 2003137810 А, МПК С 12 1/20, А 61 К 35/74, опубликован 10.03.2005). Однако штамм недостаточно устойчив к повреждающим факторам агрессивных сред гастроинтестинального тракта(кислот,протеолитических ферментов) при прохождении штамма лактобацилл в желудочно-кишечном тракте,что указывает на недостаточную его колонизирующую активность и жизнеспособность при прохождении пищеварительного тракта. Задачей заявляемого изобретения является получение штаммаАР-1 антибиотикорезистентного и антимутагенного пробиотика. Техническим результатом заявленного изобретения является антимутагенная активность и антибиотикорезистентность пробиотического штаммаАР-1. Технический результат достигается использованием штаммаАР-1 в качестве нового антибиотикорезистентного и антимутагенного пробиотика. Предлагаемый штамм получен путем многолетней селекции исходной культуры., выделенной из кишечника человека на питательной средес возрастающими концентрациями антибиотиков и воздействием УФЛ(лампа БУВ-15, доза облучения 3900 эрг/мм 2). Отобран по высокой скорости роста, высокой антимутагенной активности и устойчивости к антибиотикам,таким как офлоксацин и амоксициллин. Морфология Грамположительные палочки одиночные или расположены цепочками из 4-10 сегментов с закругленными концами. Величина клеток 0,5-1,02,4-3,8 мкм, неподвижные. Метаболизм Микроаэрофильный микроорганизм с хемогетеротрофным метаболизмом. Культуральные признаки на поверхности агаризованной среды( , Индия) колонии мелкие, ровные, выпуклые, непрозрачные диаметром 2-3 мм, молочного цвета,-типа. На 2 питательной среде бульон образует равномерное помутнение среды и диффузионный рост. Для размножения штаммаАР-1 используется среда КДС (казеинодрожжевая среда) при температуре инкубации 37,48 часов. Состав среды КДС г/л натрий хлористый 5,0 г/л,лактоза 10,0 г/л, -цистеин солянокислый 0,1 г/л,дрожжевой автолизат 650 мл/л,панкреотический гидролизат казеина с конечной концентрацией аминного азота 350 мл/л,режим стерилизации 30 минут, при 112. Хранение в лиофильно-высушенном состоянии при температуре не выше 0 на защитной среде ЖСМС. Состав защитной среды ЖСМС (желатиносахарозо-молочная среда)желатин 15-20,сахароза 5-10,молоко 50-70,стерилизация 30 минут, при 112 С. Физиологические и биохимические свойства Продукт, синтезируемый штаммом микроцин. АР-1 обладает антагонистической активностью в отношении тесткультур зона угнетения роста тест-штаммов 60 -123,111 193,59-60-235, .-13 - 192. Штамм апатогенен, не обладает гемолитической,лецитиназной,протеолитической,фосфатазной,ДНК-азной и РНК-азной активностью, а также не проявляет мутагенного действия в тесте Эймса. ШтаммАР-1 депонирован в ДГП Республиканская коллекция микроорганизмов (г. Астана) под номером 0244 от 06.03.2009 г. Сущность изобретения подтверждается следующими конкретными примерами использования штаммаАР-1. Пример 1. Результаты выращивания жидкой культуры штаммаАР-1 в условиях микробиологической лаборатории. Для получения посевного материала в ампулу с лиофилизированной культурой, содержащей 1 г сухого вещества, добавляют 1 мл стерильного раствора натрия хлорида 0,9. Посевной материал получают выращиванием микробной культуры штаммаАР-1 на поверхности агаризованной среды( , Индия) методом истощающего штриха в термостате при 37 в течение 18-20 часов. Индивидуальные клоны штаммаАР-1, выросшие на поверхности агара,помещаются в бактериологические пробирки, содержащие 9 мл среды молока и выращивают в термостате при 37 в течение 15-18 часов. Выросшие в жидкой среде лактобациллы обусловливают сквашивание молока. Из полученной культуры готовят мазки, окрашенные по Граму. В мазках должны обнаруживаться Грамположительные палочки одиночные или расположенные цепочками из 4-10 сегментов с закругленными концами. Величина клеток 0,51,02,4-3,8 мкм, неподвижные. В препаратах не должно быть посторонней микрофлоры (рисунок 1). Полученный посевной материал используют для получения стартовой биомассы. Посевной материал вносят во флаконы, содержащие 400-500 мл стерильного молока, в количестве 5 и выращивают при 37 в течение 15-18 часов. Начальная биомасса штаммаАР-1 может быть использована для выращивания больших объемов биомассы изготовления для получения пробиотиков. Пример 2. Определение антимутагенной активности в тесте Эймса. Для этого использовали индикаторные штаммыТА 98,ТА 100, ТА 1535, ТА 1538. Суспензию клеток тест-штамма предварительно инкубировали с фекальными экстрактами в течение 2 час при 37, затем клетки отмывали от него и высевали на чашки с селективной средой. Изучение протекторных свойств культуральных экстрактов бактерий проводили в трех вариантах. Первый вариант включал совместное добавление супермутагена и бесклеточного фильтрата в слой верхнего агара. Во втором случае, для определения десмутагенного действия - мутаген предварительно инкубировали с фильтратом культуральной жидкости или клетками, затем 0,3 мл смеси добавляли к суспензии клеток тест-штамма и производили посев на селективные чашки. В третьем варианте, для определения биоантимутагенного действия, было предусмотрена предобработка клеток тестерного штамма с бактериальным антимутагеноммодулятором с последующим действием мутагена. Бактериальную суспензию инкубировали вместе с антимутагеном 40 минут. После инкубации смесь центрифугировали, осадок ресуспендировали и использовали в опыте. Обработанную таким образом культуру и раствор мутагена вносили в слой верхнего полуобогащенного агара. Чашки инкубировали 48 часов при 37, после чего подсчитывали количество колоний-ревертантов в опытных и контрольных чашках. Получение микросомальной фракции-9 проводили в соответствии с рекомендуемыми методическими указаниями по первичному выявлению генетической активности среды с помощью бактериальных тест-систем. В экспериментах с метаболической активацией в реакционную систему добаляли 10 мкл микросомальной активирующей смеси, без активации-аликвоты растворителя. Эффективность антимутагенного действия рассчитывали по формуле Ингибирование(а ) х 100 / (а - с),где а - число гистидиновых ревертантов,индуцированных под действием мутагена число гистидиновых ревертантов,индуцированных под действием мутагена в присутствии антимутагена,с - число ревертантов, вырастающих в присутствии только антимутагена и выражали в процентах,отражающих степень угнетения генотоксического эффекта мутагенов. Принято считать, что антимутаген может быть перспективным для использования, если оказываемое им протекторное действие снижает уровень индуцированного мутагенеза не менее, чем на 50. В связи с этим штаммАР-1,уровень антимутагенной активности которого превосходил этот показатель более, чем на 50,считается высокоактивным (таблица 1). Пример 3. Получение антибиотикорезистентного штаммаАР-1. Устойчивый к антибиотику штаммАР-1 получали путем УФ-мутагенеза. В качестве мутагенного фактора использовали УФлучи, источником которых служили две лампы БУВ 15, смонтированные параллельно и заключенные в футляр. Доза облучения 3900 эрг/мм 2. Выживаемость облученных культур при таком режиме составляла 0,1-1, которая является оптимальной для индукции мутаций. Облучению УФ-лучами подвергали водную суспензию 24 часовой культуры (плотность 10 клеток/мл). Облучение проводили в открытой чашке Петри, перемешивание осуществлялось с помощью магнитной мешалки. Отбор антибиотикорезистентного штамма проводили методом отпечатков. Определение уровня чувствительности к антибиотикам проводили методом серийных разведений. После облучения степень устойчивости к офлоксацину у штамма. АР-1 возросла в 7,5 раз. Кроме того,после такой обработки этот штамм приобрел устойчивость к антибиотику амоксициллину(таблица 2). Таблица 1 Антимутагенная активность культуральной жидкости-1 против мутагенов в тесте Эймса с метаболической активацией Вариант опыта НММ, ТА 100 2-НФ, ТА 98 Среднее число АМЭ,Среднее число ревертантов АМЭ,ревертантов на чашку на чашку Спонтанный фон 605 182 НММ 2102 2-НФ 1476 НММКЖ 863 723 2-НФКЖ 563 752 Примечание КЖ-культуральная жидкость штамма-1 АМЭ - антимутагенный эффект НММ --нитрозо- - метилмочевина 2-НФ - 2-нитрофлуорен. Таблица 2 3 Уровень резистентности к антибиотикам после облучения ультрафиолетом Штамм ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм микроорганизма коллекция микроорганизмов под номером 0244,используемый в качестве нового антибиотикорезистентного и антимутагенного пробиотика.

МПК / Метки

МПК: C12N 1/20, A61K 35/74

Метки: качестве, пробиотика, антибиотикорезистентного, нового, lactobacillus, ap-1, антимутагенного, используемый, штамм, plantarum, микроорганизма

Код ссылки

<a href="http://kzpatents.com/4-25090-shtamm-mikroorganizma-lactobacillus-plantarum-ap-1-ispolzuemyjj-v-kachestve-novogo-antibiotikorezistentnogo-i-antimutagennogo-probiotika.html" rel="bookmark" title="База патентов Казахстана">Штамм микроорганизма Lactobacillus plantarum AP-1, используемый в качестве нового антибиотикорезистентного и антимутагенного пробиотика</a>

Похожие патенты