Способ получения основного соматического антигена чумного микроба

Номер инновационного патента: 19902

Опубликовано: 15.08.2008

Авторы: Намет Айдар Мырзахметулы, Сембина Фатима Егимбаевна, Каратаев Болат Шайзадаевич

Скачать PDF файл.

Формула / Реферат

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и может быть использовано при изготовлении аллергена для диагностики чумы верблюдов.
Технический результат, обеспечиваемый изоб-ретением выражается в изыскании оптимального способа экстракции основного соматического антигена чумного микроба с помощью 0,2% тритона Х-100, который вызывает формирование видимой зоны преципитата в РДДП в титре 1:12800, ЛПС - 1:80, F1 - 1:40.
Способ получения основного соматического антигена чумного микроба для изготовления аллергена, включающий 20 ч культивирование, смыв физиологическим раствором, центри-фугирование, экстракцию основного соматического антигена трихлоруксусной кислотой в 10 кратном количестве, последующее центрифугирование, нейтрализацию надосадочной жидкости, диализ, осаждение и лиофилизацию конечного продукта, достигается тем, что в качестве исходного материала используют вакцину чумную сухую живую из штамма Yersinia pestis EV, которую регидратируют физиологическим раствором, затем экстрагируют 0,2% раствором тритона Х-100 в соотношении 1:5, полученную смесь подвергают 9 ч непрерывному перемешиванию в шуттель-аппарате при 37°С, после чего центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин, осадок отбрасывают, а полученную надосадочную жидкость диализуют против дистиллированной воды в течение 36 ч, затем к диализованному раствору добавляют 5 объемов этилового спирта 96°, смесь центри-фугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин, полученный осадок подвергают высушиванию и получают целевой продукт.
1 табл.

Текст

Смотреть все

(51) 61 39/02 (2006.01) 61 10/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ зоны преципитата в РДДП в титре 112800, ЛПС 180, 1 - 140. Способ получения основного соматического антигена чумного микроба для изготовления аллергена, включающий 20 ч культивирование,смыв физиологическим раствором,центрифугирование, экстракцию основного соматического антигена трихлоруксусной кислотой в 10 кратном количестве,последующее центрифугирование,нейтрализацию надосадочной жидкости, диализ,осаждение и лиофилизацию конечного продукта,достигается тем, что в качестве исходного материала используют вакцину чумную сухую живую из штамма, которую регидратируют физиологическим раствором, затем экстрагируют 0,2 раствором тритона Х-100 в соотношении 15, полученную смесь подвергают 9 ч непрерывному перемешиванию в шуттель-аппарате при 37 С, после чего центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин, осадок отбрасывают, а полученную надосадочную жидкость диализуют против дистиллированной воды в течение 36 ч,затем к диализованному раствору добавляют 5 объемов этилового спирта 96, смесь центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин,полученный осадок подвергают высушиванию и получают целевой продукт. 1 табл.(72) Сембина Фатима Егимбаевна Намет Айдар Мырзахметулы Каратаев Болат Шайзадаевич(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научно-исследовательский ветеринарный институт Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Научно-производственный центр животноводства и ветеринарии Министерства сельского хозяйства Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОСНОВНОГО СОМАТИЧЕСКОГО АНТИГЕНА ЧУМНОГО МИКРОБА(57) Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и может быть использовано при изготовлении аллергена для диагностики чумы верблюдов. Технический результат, обеспечиваемый изобретением выражается в изыскании оптимального способа экстракции основного соматического антигена чумного микроба с помощью 0,2 тритона Х-100, который вызывает формирование видимой 19902 Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и может быть использовано при изготовлении аллергена для диагностики чумы верблюдов. Известен способ экстракции чумного микроба с помощью трихлоруксусной кислоты, включающий 20 ч культивирование, смыв физиологическим раствором, центрифугирование, экстракцию основного соматического антигена трихлоруксусной кислотой в 10 кратном количестве, последующее центрифугирование, нейтрализацию надосадочной жидкости, диализ, осаждение и лиофилизацию конечного продукта В.А.Шамардин., Т.И.Тугамбаев. В кн. Диагностические сорбированные иммунореагенты, Алматы, 1989, с.30-31. Недостатком этого способа является то, что при воздействии на клетки возбудителя чумы трихлоруксусной кислотой в реакции двойной диффузной преципитации выявляются зоны преципитата не только к соматическому антигену, но и к капсульному и к липополисахаридному антигенам. Задачей изобретения является получение основного соматического антигена чумного микроба с низким содержанием сопутствующих антигенов. Технический результат, обеспечиваемый изобретением выражается в изыскании оптимального способа экстракции основного соматического антигена чумного микроба. Способ получения основного соматического антигена чумного микроба для изготовления аллергена, включающий 20 ч культивирование,смыв физиологическим раствором, центрифугирование, экстракцию основного соматического антигена трихлоруксусной кислотой в 10 кратном количестве,последующее центрифугирование,нейтрализацию надосадочной жидкости, диализ,осаждение и лиофилизацию конечного продукта, в качестве исходного материала используют вакцину чумную сухую живую из штамма,которую регидратируют физиологическим раствором, затем экстрагируют 0,2 раствором тритона Х-100 в соотношении 15, полученную смесь подвергают 9 ч непрерывному перемешиванию в шуттель-аппарате при 37 С,после чего центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин,осадок отбрасывают, а полученную надосадочную жидкость диализуют против дистиллированной воды в течение 36 ч, затем к диализованному раствору добавляют 5 объемов этилового спирта 96, смесь центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин, полученный осадок подвергают высушиванию и получают целевой продукт. Вакцинный штаммиспользуют для изготовления вакцины против чумы. Указанный штамм бактерий депонирован в музее живых культур микроорганизмов РГКП Казахский научный центр карантинных и зоонозных инфекций им. М.Айкимбаева. Идентификацию штамма бактерийпроводят по морфологическим, культуральным,физиолого-биохимическим свойствам. Морфологические признаки. Бактерии штамма грамотрицательные округлые палочки от 1-2 х 0,32 0,7 мкм, неподвижные, имеют капсулу, спор не образуют. Культуральные свойства. На агаре Хоттингера вырастают шероховатые, в центре бугристые желтовато-белые, на периферии с кружевной каймой колонии в -форме. Накопление бакмассы наблюдают через 24-48 ч выращивания. В питательном бульоне образуют хлопьевидный,легко распадающийся при встряхивании осадок. Аэробы. Оптимальная температура выращивания 28-30 С, рН 7,0-7,2. Биохимические свойства. Не продуцируют уреазу и ацетилметилкарбинол, не разжижают желатин, не расщепляют маланат, не образуют 2,индол, ацетоин. Проба на диссоциацию. По Грамму колонии окрашиваются как -форма. Патогенные свойства. Авирулентен для белых мышей и морских свинок. Серологические свойства. Синтез капсульного антигена - фракция 1, титр в РНГА с чумной агглютинирующей диагностической сывороткой не ниже 1200000. Физиолого-биохимические свойства. Хемогетеротроф. Тип катаболизма - аэроб. Оптимальный рН - 7,0-7,2. Источники углерода манит, манноза, глюкоза,мальтоза, маннитол, сорбитол, амигдалин. Источники азота аминокислоты в составе питательных сред. Источники серы аминокислоты в составе питательных сред. Биохимические маркерные признаки не ферментирует лактозу, сахарозу, рамнозу, глицерин,дает положительный результат в реакции денитрификации. Физиологические маркерные признаки природный ауксотроф, нуждается в метионине, цистеине,фенилаланине и треонине. Хранение на питательной среде. Предварительно культивируют на агаре Хоттингера с добавлением 0,1 гемолизированной крови при температуре 28 С в аэробных условиях, хранят в лиофильно высушенном состоянии при температуре 4-6 С в течение 36 мес. В качестве экстрагирующего реагента для получения основного соматического антигена чумного микроба используют тритон Х-100. Тритон Х-100 (1422(24 является неионным поверхностно активным веществом,которое имеет гидрофильную полиэтиленоксидную группу (в среднем 9,5 этиленоксидных единиц) и углеводородную липофильную или гидрофобную группу. Углеводородная группа 4-(1.1.3.3-тетраметил бутил)-фенил группа. Он связан с плуороническим рядом детергента реализуемых БАСФ. Плуорники трехблочные сополимеры этиленоксида и пропилен оксида. Часть,образованная этиленоксидом, более гидрофильная,чем часть образованная пропиленоксидом. Это очень вязкая при комнатной температуре жидкость и ее легче использовать, если немного подогреть. Он 19902 может быть использован при экстракциях, как составляющая буферного раствора (обычно 5 раствор в щелочном лизирующем буфере)// -00-100. 3,3-. Способ получения основного соматического антигена чумного микроба для изготовления аллергена заключается в следующем. Пример 1. На основе штаммаизготавливают вакцину сухую живую против чумы верблюдов, которую используют в качестве сырья для получения культуры. Вакцина против чумы верблюдов представляет собой высушенную живую культуру вакцинного штамма чумного микроба ЕВ линии НИИЭГ,лиофилизированную в стабилизирующей среде,содержащей 10 сахарозы, 1 желатина, 1,5 глютаминово-кислого натрия, 0,5 тиомочевины и 0,05 пептона. Для получения микробной взвеси сухую вакцину регидратируют в физиологическом растворе (0,85 раствор хлористого натрия). Пример 2. Микробную массу суспендируют в десятикратном количестве 0,25 н растворе трихлоруксусной кислоты. Суспензию оставляют на леднике в течение 3 ч, после чего центрифугируют при 8-10 тыс.об/мин в течение 40 мин. Полученную надосадочную жидкость нейтрализуют добавлением углекислого натрия, затем диализуют против водопроводной воды в течение 2 суток и против дистиллированной воды в течение суток. Из раствора антиген осаждают 3-5 объемами 96 этилового спирта и высушивают. При постановке реакции двойной диффузной преципитации (РДДП) с кроличьими иммунными сыворотками, полученными иммунизацией животных изолированными антигенами - основного соматического антигена(1), формирование видимой зоны преципитата у ОСА, полученного экстракцией ТХУ возникает в титре 13200, ЛПС 1320, 1 1160. Пример 3. В качестве исходного материала используют вакцину чумную сухую живую из штамма, которую регидратируют физиологическим раствором, затем экстрагируют 0,1 раствором тритона -100 в соотношении 15,полученную смесь подвергают 9 ч непрерывному перемешиванию в шуттель-аппарате при 37 С,после чего центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин, осадок отбрасывают, а полученную надосадочную жидкость диализуют против дистиллированной воды в течение 36 ч, затем к диализованному раствору добавляют 5 объемов этилового спирта 96, смесь центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин, полученный осадок подвергают высушиванию. При постановке РДДП с кроличьими иммунными сыворотками, полученными иммунизацией животных изолированными антигенами - ОСА,ЛПС, 1, формирование видимой зоны преципитата у ОСА, полученного экстракцией 0,1 раствором тритона Х-100 формирование видимой зоны преципитата в РДДП возникает в титре 13200, ЛПС 1160, 1 180. Пример 4. В качестве исходного материала используют вакцину чумную сухую живую из штамма, которую регидратируют физиологическим раствором, затем экстрагируют 0,2 раствором тритона -100 в соотношении 15,полученную смесь подвергают 9 ч непрерывному перемешиванию в шуттель-аппарате при 37 С,после чего центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин, осадок отбрасывают, а полученную надосадочную жидкость диализуют против дистиллированной воды в течение 36 ч, затем к диализованному раствору добавляют 5 объемов этилового спирта 96, смесь центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин, полученный осадок подвергают высушиванию. При постановке РДДП с кроличьими иммунными сыворотками, полученными иммунизацией животных изолированными антигенами - ОСА,ЛПС, 1, формирование видимой зоны преципитата у ОСА, полученного экстракцией 0,2 раствором тритона Х-100 формирование видимой зоны преципитата в РДДП возникает в титре 112800,ЛПС 180, 1 140. Пример 5. В качестве исходного материала используют вакцину чумную сухую живую из штамма, которую регидратируют физиологическим раствором, затем экстрагируют 0,3 раствором тритона -100 в соотношении 15,полученную смесь подвергают 9 ч непрерывному перемешиванию в шуттель-аппарате при 37 С,после чего центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин, осадок отбрасывают, а полученную надосадочную жидкость диализуют против дистиллированной воды в течение 36 ч, затем к диализованному раствору добавляют 5 объемов этилового спирта 96, смесь центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин, полученный осадок подвергают высушиванию. При постановке РДДП с кроличьими иммунными сыворотками, полученными иммунизацией животных изолированными антигенами - ОСА,ЛПС, 1, формирование видимой зоны преципитата у ОСА, полученного экстракцией 0,3 раствором тритона Х-100 формирование видимой зоны преципитата в РДДП возникает в титре 112800,ЛПС 180, 1 140. Результаты РДДП приведены в таблице. Из таблицы видно, что в опытах с противочумной сывороткой наибольшую активность показали препараты экстрагированные 0,2 раствором тритона Х-100. Они способны вызывать формирование видимой зоны преципитата с ОСА в титре 112800, с наименьшим количеством сопутствующих антигенов - ЛПС 180, 1 140. Для образования подобной полосы преципитата для препаратов, экстрагированных трихлоруксусной кислотой и 0,1 раствором тритона Х-100 потребовалось больше нагрузки. При этом сопутствующие антигены выявляются в более высоких титрах. Увеличение тритона Х-100 до 0,3 концентрации не приводит к существенным изменениям. 3 19902 Полученные результаты исследований дают основание считать, что применение способа экстракции с помощью 0,2 раствора тритона Х 100 повышает антигенную активность и количественное содержание основного соматического антигена чумного микроба. Таблица Серологическая активность в РДДП различных экстрактов чумного микроба из штамма ЕВ Препарат Экстрагирован 0,25 н раствором трихлоруксусной кислоты Экстрагирован 0,1 тритоном Х-100 Экстрагирован 0,2 тритоном Х-100 Экстрагирован 0,3 тритоном Х-100 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения основного соматического антигена чумного микроба для изготовления аллергена, включающий 20 ч культивирование,смыв физиологическим раствором,центрифугирование, экстракцию основного соматического антигена трихлоруксусной кислотой в 10 кратном количестве,последующее центрифугирование,нейтрализацию надосадочной жидкости, диализ,осаждение и лиофилизацию конечного продукта,отличающийся тем, что в качестве исходного материала используют вакцину чумную сухую живую из штамма, которую Образование зон преципитата при взаимодействии с противочумными сыворотками ОСА - 13200 ЛПС- 1320 1 - 1160 ОСА- 13200 ЛПС- 1160 1 - 180 ОСА- 112800 ЛПС- 180 1 - 140 ОСА- 112800 ЛПС - 180 1 - 140 регидратируют физиологическим раствором, затем экстрагируют 0,2 раствором тритона Х-100 в соотношении 15, полученную смесь подвергают 9 ч непрерывному перемешиванию в шуттель-аппарате при 37 С, после чего центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин, осадок отбрасывают, а полученную надосадочную жидкость диализуют против дистиллированной воды в течение 36 ч,затем к диализованному раствору добавляют 5 объемов этилового спирта 96, смесь центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин,полученный осадок подвергают высушиванию и получают целевой продукт.

МПК / Метки

МПК: A61K 39/02, A61B 10/00

Метки: чумного, микроба, основного, получения, антигена, способ, соматического

Код ссылки

<a href="http://kzpatents.com/4-ip19902-sposob-polucheniya-osnovnogo-somaticheskogo-antigena-chumnogo-mikroba.html" rel="bookmark" title="База патентов Казахстана">Способ получения основного соматического антигена чумного микроба</a>

Похожие патенты