Штамм микроорганизма Helicobacter pylori GB1 (B-0573), используемый при разработке методов диагностики хеликобактер-ассоциированных заболеваний

Скачать PDF файл.

Формула / Реферат

РЕФЕРАТ
ШТАММ МИКРООРГАНИЗМА HELICOBACTER PYLORI GBl(B-0573), ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ МЕДИЦИНСКОЙ ДИАГНОСТИКИ.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине при разработке методов диагностики хеликобактер-ассоциированных заболеваний.
Новый штамм Helicobacter pylori пополняет коллекцию микроорганизмов Национального референтного центра по ветеренарии.
Штамм Helicobacter pylori генотипирован по 16S рРНК, охарактеризован на гены факторов вирулентности такие, как cagA, cagE, vacA, iceA, ЪаЪА, hopQ.
Для получения штамма продуцента использовали биопсию слизистой оболочки желудка пациента с патологией желудочно-кишечного тракта, с которой проводили посев на плотную питательную селективную среду Columbia agar в микроаэрофильных условиях. Посевы инкубируются при температуре 37°С, влажности 98%, в микроаэрофильных условиях в течение 3-10 суток. H.pylori растет в атмосфере, содержащей 5% кислорода, 5-10% углекислого газа, остальное составляет азот. Для данного микроорганизма губительны как анаэробные условия, так и более высокое содержание кислорода. Для создания микроаэрофильной атмосферы используют газогенераторные пакеты, которые продуцируют газовые смеси после добавления в них воды. Оптимальный рост колоний наблюдают при рН среды от 6,7 до 8,0. Время инкубации: 5 дней.
Штамм H.pylori GBl(B-0573) с известными генами вирулентности может служить как контроль для разрабатываемых тест-систем в клинической медицинской диагностике.

Текст

Смотреть все

(51) 12 1/20 (2011.01) 01 33/53 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Штаммгенотипирован по 16 рРНК, охарактеризован на гены факторов вирулентности такие, как , , , ,А, . Для получения штамма продуцента использовали биопсию слизистой оболочки желудка пациента с патологией желудочно-кишечного тракта, с которой проводили посев на плотную питательную селективную средув микроаэрофильных условиях. Посевы инкубируются при температуре 37 С, влажности 98, в микроаэрофильных условиях в течение 3-10 суток. . растет в атмосфере, содержащей 5 кислорода, 5-10 углекислого газа, остальное составляет азот. Для данного микроорганизма губительны как анаэробные условия, так и более высокое содержание кислорода. Для создания микроаэрофильной атмосферы используют газогенераторные пакеты, которые продуцируют газовые смеси после добавления в них воды. Оптимальный рост колоний наблюдают при рН среды от 6,7 до 8,0. Время инкубации 5 дней. Штамм . 1(-0573) с известными генами вирулентности может служить как контроль для разрабатываемых тест-систем в клинической медицинской диагностике.(72) Кулмамбетова Гульмира Нигметжановна Иманбекова Меруерт Куатбековна Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(-0573),ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ПРИ РАЗРАБОТКЕ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ХЕЛИКОБАКТЕРАССОЦИИРОВАННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине при разработке методов диагностики хеликобактерассоциированных заболеваний. Новый штаммпополняет коллекцию микроорганизмов Национального референтного центра по ветеринарии. Изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового штамма бактерии,который может быть использован при разработке методов диагностики хеликобактерассоциированных заболеваний. В настоящее время установлено, что бактерияявляется причиной развития хеликобактерного хронического гастрита,важнейшим фактором патогенеза язвенной болезни двенадцатиперстной кишки и желудка, лимфомы желудка низкой степени злокачественности (мальтлимфомы), а также рака желудка. Лечение ряда заболеваний гастродуоденальной зоны включает в себя в качестве обязательного компонента проведение эрадикационной терапии в случае обнаружения у больных в слизистой оболочке желудка Н За последние 20 лет было разработано большое количество методов диагностики, позволяющих выявлять и идентифицировать этот микроорганизм. Развитие и усовершенствование этих методов помогло в получении ценной информации об эпидемиологии хеликобактериоза,сыграло большую роль в понимании патогенеза этой инфекции. Это, в свою очередь, позволило разработать наиболее эффективные схемы противохеликобактерной терапии и мероприятия,направленные на профилактику хеликобактериоза. Тем не менее, ни один из существующих методов диагностики . - инфекции не универсален. Пределы возможностей этих методов могут быть ограничены не только их чувствительностью, но,зачастую зависят от возраста пациента, его индивидуальных особенностей, стадии заболевания,а также индивидуальных характеристик инфекции. Штамм . В-0573 с известной генетической характеристикой может служить как контроль для разрабатываемых тест-систем в клинической медицинской диагностике. Известен штамм 99(700824) , 85963 выделенный от пациента с дуоденальной язвой, США (99,..2008-09-01). Недостатком указанного штамма является отсутствие гена . Задачей изобретения является получение нового штамма, с известными генами вирулентности , 1, , , , ,используемого в медицинской диагностике. Технический результат - положительный контрольный образец в молекулярно-биологических тест-системах для медицинской диагностики. Характеристика штамма. Происхождение штамма. Описанный штаммВ-0573 выделен от пациента с хроническим гастритом. спиралевидная грамотрицательная бактерия, около 3 мкм в длину,диаметром около 0,5 мкм. В неблагоприятных условиях, а также в зрелых или старых культурах обладает способностью превращаться из спиралевидной в круглую или шарообразную кокковидную форму. Таксономическая принадлежность. Царство бактерии, тип протеобактерии, класс эпсилон-протеобактерии,порядок, семейство ,род , вид. Культурально-морфологические признаки. При культивировании . возникают определенные трудности,так как эти микроорганизмы микроаэрофилы и растут в особых условиях. Необходимую для культивирования атмосферу создавали заполнением анаэростатов газовой смесью. Таким образом, инкубация чашек с посевами производили в микроаэрофильной атмосфере (5 2, 10 С 2, 85 2)100, в течение 57 дней. Поскольку для данного микроорганизма губительны как анаэробные условия, так и более высокое содержание кислорода. Оптимальный рост колоний наблюдался присреды от 6,7 до 8,0 при 37 С. Состав среды представлен в таблице 1. Таблица 1 Питательная среда, использованная для выделения . Посевы инкубируются при температуре 37 С,влажности 98, в микроаэрофильных условиях в течение 3-10 сут. Н.растет в атмосфере,содержащей 5 кислорода, 5-10 углекислого газа,остальное составляет азот. Для создания микроаэрофильной атмосферы используют газогенераторные пакеты, которые продуцируют газовые смеси после добавления в них воды. Оптимальный рост колоний наблюдают присреды от 6,7 до 8,0. Время инкубации 5 дней. Колонии Н. приобретают характерное золотисто-желтое окрашивание,за счет 2 колумбийский агар - 39 г дистиллированная вода 1000 мл стерильная лошадиная донорская сыворотка- 20 стерильный дрожжевой автолизат-10 колистин- 1 мл/л (7,5 мг/мл) присутствующего в этой среде трифенилтетразолий хлорида. Н.на 3-5 сутки при первичном посеве и на 2 сутки при пересевах чистой культуры формирует мелкие, круглые, гладкие, прозрачные,росинчатые колонии диаметром 1-3 мм. На твердых питательных средах бактериальные клетки образуют гладкие мягкой консистенции матовые, бесцветные,однородной структуры. Н. не ферментирует глюкозу, не продуцирует нитраты, не образует индол. При появлении колоний,сходных по морфологии с Н. (диаметром до 0,5 - 2 мм в виде капель росы или при сплошном росте,образующие прозрачную пленку), происходит их идентификация. Для идентификации мазки окрашивают по Грамму. Под микроскопом в случае Н.обнаруживают грамотрицательные изогнутые палочки. Проводят биохимическое типирование уреазная, каталазная, оксидазная активность. Идентификация штамма была также осуществлена методом определения прямой нуклеотидной последовательности фрагмента 16 гена, с последующим определением нуклеотидной идентичности с последовательностями депонированными в международной базе данных. Амплификация фрагмента 16 гена Реакция ПЦР была выполнена с универсальными праймерами 8 5 - -3 и 806- 5 в общем объеме 20 мкл. ПЦР смесь содержала 150 нг ДНК,1 Ед., 2,52, 10 пмоль каждого праймера. Программа ПЦР амплификации включала длительную денатурацию 95 С в течение 7 минут 30 циклов 95 С - 30 секунд, 55 С- 40, 72 С - 1 минута заключительная элонгация 7 минут при 72 С, ПЦР программа была выполнена с применением амплификатора 9700 ( ). Результаты ПЦР амплификации детектировались электрофоретически в 2 агарозном геле в УФ трансэлюминаторе. Наличие яркой специфической полосы на уровне 800 п.н. свидетельствует о прохождении ПЦР. Определение нуклеотидной последовательности Очистку ПЦР продуктов от не связавшихся праймеров проводили, ферментативным методом используя,и щелочную фосфатазу (, ). Реакцию секвенирование проводили с применением 3.1( ) согласно инструкции производителя,с последующим разделением фрагментов на автоматическом генетическом анализаторе 37301 Нуклеотидные последовательности 16 гена идентифицируемого штамма были анализированы и объединены в общую последовательность в программном обеспечении 2.6.0 ( ). После чего были удалены концевые фрагменты (нуклеотидные последовательности праймеров,фрагменты,имеющие низкий показатель качества) что позволило нам получить нуклеотидную последовательность протяженностью 730 п.н.,которые были идентифицированы впо алгоритму. Нуклеотидные последовательности и результаты идентификации представлены ниже. Размер генома, наличие и характеристика плазмид геном 1643831 пар оснований. НМ 046432.1.64 16,В результате генотипирования (таблица 2) выделенный штамм был идентифицирован как вид Н. . Таблица 2 Результат идентификации штамма методом анализа фрагмента 16 гена использованы,как молекулярно-биологическая характеристика штамма. Контаминация. Контаминантов в клетках включая бактерии, грибы, дрожжи и микоплазмы не обнаружено. Криоконсервация. Среда для хранения культуры В с добавлением 30 3 деградации и разрушения межклеточного матрикса и базальной мембраны, опухолевой инвазии и метастазировании в раковые клетки в желудке,стимуляции выработки интерлейкина-8,способствует повышению активности антрального гастрита. Ген вакуолизирующего цитотоксинафактор адгезии, увеличивает проницаемость мембран по отношению к анионам, достоверно уменьшает скорость реэпителизации экспериментальных язв и пролиферацию эпителиоцитов за счет нарушения функции клетки,связанных с целостностью ее цитоскелета,пассивный транспорт мочевины через эпителиальные клетки желудка, влияет на выживание Н.в клетках хозяина, снижает содержание АТФ в эпителиоцитах, стимулирует апоптоз клеток. Адгезин , рецептор клеток ,предположительно связан с более высокой частотой развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, осложнений инфекции Н. , а также с аденокарциномой желудка (ВаА 2). Адгезининдуцирует контакт с эпителием. Ген цитотоксичности - , существующий в двух аллельных вариантах(встречается при язвенной болезни) и 2 (обнаруживается при гастрите). Предполагается, что патогенность продуктов, кодируемых этим геном, определяется влиянием их на активность бактериального фермента метилтрансферазы. Таблица 3 Определение факторов вирулентности , , , , аА,в штамме .и 20 глицерина (хранить 4). Среду разлить по 0,5-0,3 мл, аликвотить строго до работы с культурой. Собрать клетки с 1/2 чашки 48-ми часовой культуры Условия размораживания. Достать замороженную пробирку с -70, разморозить,ресуспендировать наконечником на чашку с агаром перенести 100 мкл и полностью втереть шпателем,этим же шпателем провести по новой чашке для получения одиночных колоний. Число жизнеспособных клеток после размораживания не менее 85. Для увеличения жизнеспособности крио культуры проводится посев в жидкую среду В с добавлением 10 и 5 дрожжевого автолизата, инкубирование при 37 С, в течение 24-120 часов до 6000,8. Штамм микроорганизма В-0573 используют следующим образом. Пример 1. Способность Н.колонизировать слизистую желудка и вызывать гастрит либо язву желудка зависит от индивидуальных особенностей конкретного штамма бактерии. Были определены шесть факторов вирулентностицитотоксинассоциированный антигенвакуолизирующий токсини факторы адгезии , 2 ПЦР в реальном времени проводили на приборе 5 (, США) с использованием следующих реактивов десятикратный ПЦР-буфер (670 мМ( 8.8), 166 мМ (4)24 Х-100), 25 мМ 2) смесь(250 мкМ), растворы олигонуклеотидов (5 пмоль/ мкл), термостабильная ДНК-полимераза (-, 5 ед/мкл), деионизованная вода (2). Все перечисленные реактивы производились НПФ Литех, Москва. Реакция амплификации проходит в 20 мкл смеси,содержащей 1 мкл ДНК Н. , 2 мкл ПЦРбуфера 10 (Литех, Москва), 2 мкл 10(Литех, Москва), 2 мкл 25 мМ 2 (Литех,Москва), по 1 мкл каждого праймера, 0,5 мкл зонда,0,1 мкл - (Литех, Москва), 11 мкл 2 при следующих температурных режимах 95 С -1 мин 94 С- 15 сек 55 С-20 сек 68 С - 20 сек - 45 циклов. Результаты о наличии генов вирулентности детектируются графически на приборе путм визуального накопления ПЦР продуктов амплификации специфических фрагментов гена ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм микроорганизма 1,депонированный в коллекции депозитарии ГУ Национальный референтный центр по ветеринарии КГИ в АПК МСХ РК, лаборатория Национальная коллекция депонированных штаммов микроорганизмов, под регистрационным номером -0573, используемый при разработке методов диагностики хеликобактерассоциированных заболеваний.

МПК / Метки

МПК: C12N 1/20, G01N 33/53

Метки: helicobacter, b-0573, штамм, pylori, разработке, микроорганизма, методов, хеликобактер-ассоциированных, заболеваний, диагностики, используемый

Код ссылки

<a href="http://kzpatents.com/4-ip26385-shtamm-mikroorganizma-helicobacter-pylori-gb1-b-0573-ispolzuemyjj-pri-razrabotke-metodov-diagnostiki-helikobakter-associirovannyh-zabolevanijj.html" rel="bookmark" title="База патентов Казахстана">Штамм микроорганизма Helicobacter pylori GB1 (B-0573), используемый при разработке методов диагностики хеликобактер-ассоциированных заболеваний</a>

Похожие патенты