Штамм бактерии fusobacterium necrophorum в-0185, используемый для изготовления вакцины против некробактериоза крупного рогатого скота

Номер инновационного патента: 27907

Опубликовано: 25.12.2013

Авторы: Горелов Юрий Михайлович, Канатов Бегали, Сущих Владислава Юрьевна

Скачать PDF файл.

Формула / Реферат

ШТАММ БАКТЕРИИ FUSOBACTERIUM NECROPHORUM В-0185, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ НЕКРОБАКТЕРИОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Изобретение относится к области ветеринарии, в частности ветеринарной микробиологии и представляет собой штамм Fusobacterium necrophorum, используемый для приготовления антигена для изготовления вакцинных препаратов против некробактериоза крупного рогатого скота.
Технический результат, обеспечиваемый изобретением, выражается в изыскании иммуногенного, вирулентного штамма Fusobacterium
necrophorum.
Штамм бактерий Fusobacterium necrophorum В-0185, депонирован в лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов ТОО «Казахский научно - исследовательский ветеринарный институт», используемый для изготовления вакцинных препаратов против некробактериоза крупного рогатого скота.

Текст

Смотреть все

(51) 12 1/20 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ представляет собой штамм, используемый для приготовления антигена для изготовления вакцинных препаратов против некробактериоза крупного рогатого скота. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в изыскании иммуногенного,вирулентного штамма. Штамм бактерийВ 0185, депонирован в лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научно исследовательский ветеринарный институт,используемый для изготовления вакцинных препаратов против некробактериоза крупного рогатого скота.(72) Горелов Юрий Михайлович Сущих Владислава Юрьевна Канатов Бегали(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(54) ШТАММ БАКТЕРИИВ-0185, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ НЕКРОБАКТЕРИОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА(57) Изобретение относится к области ветеринарии,в частности ветеринарной микробиологии и Изобретение относится к области ветеринарии, в частности ветеринарной микробиологии и представляет собой штамм, используемый для приготовления антигена для изготовления вакцинных препаратов против некробактериоза рогатого скота. Известен штамм бактерии- О-1 (ВГНКИ), используемый для изготовления фабричных вакцин производства ФГУП Щелковского биокомбината ТУ 9384-03200482915-03 Вакцина против некробактериоза животных эмульгированная инактивированная, М.,2003. Недостатком известного штамма является возможность утраты вирулентности вследствие длительных пересевов и отсутствие пассажей на восприимчивых животных. Задачей данного изобретения является получение вирулентного и высокоиммуногенного штамма с типичными культурально-морфологическими, биохимическими,антигенными свойствами. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в изыскании иммуногенного,вирулентного штамма. Штамм бактерииВ 0185, депонирован в Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научно исследовательский ветеринарный институт, используемый для приготовления вакцинных препаратов против некробактериоза рогатого скота. Идентификацию штамма бактерий проводят по основным культурально - морфологическим,биохимическим и антигенным свойствам, согласно определителю(2010, том 4, с.610-623,Справочное издание). Селекция штамма. Штамм В-0185 выделен из срезов пораженной конечности дойной коровы, принадлежащей АО Айдарбаев Е.С., Енбекшиказахского района,Алматинской области. Срезы конечности засевали погружением в мясопептонно-печеночный бульон (МППБ) под вазелиновым маслом. Посевы культивировали в термостате при 37 С 20-24 часа. Отмечали равномерное помутнение МППБ и обильное газообразование. Затем из пробирок с МППБ делали посевы на мясопептонно-печеночный бульон во флаконы, объемом 100 см 3. При посеве отдельных проб, полученных с первичных посевов, отмечали,что при пересеве их в МППБ во флаконы при 24 часах инкубации и дальнейшем пересеве в одинаковой дозировке 1,0 см 3 на 10,0 см 3 на МППБ отмечали неодинаковое накопление бакмассы. Значительная временная разница в интенсивности роста, выделенной от коровы культуры, указывала на неоднородность популяциипо репродуктивной активности,накоплению бакмассы и скорости роста. Исходя из результатов исследований, в целях получения однородного популяционного свойства бактерий,2 обладающих сравнительно короткой лагфазой,сопровождающейся накоплением более высоким количеством бактериальной массы, были проведены исследования по отбору некробактериозной культуры с активными ростовыми свойствами и последующим их пассажем через организм лабораторных животных, в частности белых мышей. С этой целью методом разведений выделяли пробы культуры, выросших во флаконах с МППБ,которые при последующем пересеве их в пробирки с МППБ давали наиболее обильный рост. Накопление бактериальной массы определяли по бактериальному стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича. Селекционное выделение клонов,отличающихся по скорости репродукции, проводили последовательно двукратно,затем клоны размножали и после этого изучали их активность по наибольшему накоплению бактериальной массы. В результате проведенного клонирования был выделен изолят 7 из популяции штаммаВ-0185, который был отобран для дальнейшей работы, так как за 20 часов культивирования в термостате на МППБ накопление бактериальной массы составляло более 5 миллиардов микробных клеток в 1,0 см 3 МППБ. У остальных клонов этот показатель был несколько ниже (около 3-4 млрд. м.к./см 3 и ниже). Для заражения белых мышей использовали опытные суточные бульонные культуры МППБ под вазелиновым маслом, полученные от разных изолятов. Суточную бульонную культуру МППБ вводили под кожу в область корня хвоста в объеме 0,2-0,3 мл, при этом каждым изолятом заражали по три белые мыши. Наблюдение за опытными животными вели в течение 10 суток. В результате проведенного пассажа через организм белой мыши, был также отобран изолят 7, введение которого вызывало образование некротических поражений на месте введения в течение 5-6 суток. При введении остальных изолятов время заражения животных значительно увеличивалось (от 8 до 11 суток с момента введения). При повторной проверке выбранного штамма(изолят 7) через 3 месяца после хранения на мясопептонном-печеночном бульоне под вазелиновым маслом под резиновыми парафинированными пробками была установлена стабильность клона в быстроте роста, что указывало на целесообразность его использования при проведении дальнейших исследований по отбору штамма для изготовления вакцинных препаратов. Изолят 7 был условно обозначен штаммом В-0185,который депонирован в коллекции лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов ТОО Научно исследовательский ветеринарный институт. Морфологические признаки. В - 0185 -изолированные тонкие длинные нити со слегка обрубленными концами, 812 мкм в длину и 0,2-0,4 мкм в ширину. Неподвижные, спор и капсул не образуют. В - 0185 -строгие анаэробы. Хорошо развиваются в анаэробных питательных средах,оптимальная температура роста 37 С, при рН среды 7,2-7,6. На МППБобразуют равномерное помутнение жидкой среды с образованием бело-серого осадка на дне пробирки и обильным газообразованием. На глюкозо-кровяном агаре Цейслера образуют круглые, сочные колонии с неровными краями окруженные зоной гемолиза. На обычных питательных средах МПБ и МПА культуране растет. Для культивированияиспользуют также среды накопления гидролизатные среды. Учет характера роста необходимо проводить через 24 - 48 часов. Биохимические свойства. ШтаммВ-0185 не ферментирует сахарозу,маннит, рамнозу, раффинозу, дульцит. ШтаммВ-0185 ферментирует с образованием масляной кислоты и незначительного количества газа глюкозу, сахарозу, мальтозу,инулин. Слабо ферментирует лактозу. Образуют сероводород и индол. Не ферментирует мочевину, разлагает желатин. ШтаммВ-0185 обладает каталазаположительными,оксидазаотрицательными и уреазаотрицательными свойствами. Умеренно восстанавливает нитраты в нитриты, продуцирует сероводород. Антигенная структура. ШтаммВ-0185 является эпизоотическим,обладает патогенными свойствами для крупного и мелкого рогатого скота и высокой вирулентностью для белых мышей (250 тыс. м. к. при подкожном введении). За время хранения и пересевах в лабораторных условиях штаммВ-0185 не изменил культурально морфологических, биохимических свойств, также патогенность,вирулентность и антигенную структуру. Маркерные признаки штаммаВ-0185. Физиологические - прототроф,хемоорганотроф,обладает дыхательным и бродильным типом метаболизма. Анаэроб. Образовывает сероводород и индол,не ферментирует лактозу и сахарозу. Возможна диссоциация из - в - форму, приобретение лекарственной устойчивости. Серологические при типизации с диагностическими агглютинирующими сыворотками имеет постоянную реакцию и образует комплекс агглютинирующих антител в титрах 132164. Патогенные свойства. Штамм В-0185 обладает патогенными свойствами для белых мышей массой 16-18 граммов, и кроликов 2,0-2,5 килограммов при подкожном введении 0,2 см 3 и 0,5 см 3 суточной бульонной культуры, соответственно вызывая гибель всех опытных животных. свойствами для крупного и мелкого рогатого скота. При подкожном введении 2-4 млрд м. к./см 3 штаммВ-0185 вызывает некротические поражения на месте введения у овец и коров, соответственно. Вирулентность для белых мышей. Штамм В-0185 обладает выраженной вирулентностью для белых мышей массой 16-18 граммов, вызывая заражение 100 животных при подкожном введении суточной бульонной культуры в дозе 0,2 см 3 на 5-6 сутки. Пример. Питательной средой для получения бакмассы при изготовлении вакцинных препаратов против некробактериоза животных служит питательная среда на бульоне по Хоттингеру,которая состоит из бульона Хоттингера и экстракта печени (200-250 мг аминного азота), содержащая 70 бульона по Хоттингеру и 30 печеночного экстракта. Для приготовления питательной среды используют основной перевар Хоттингера. На 1,0 кг мясного фарша добавляют 15 см 3 дистиллированной воды, подогретой до 40 С, и подщелачивают 20 раствором едкого натра, так чтобы концентрация водородных ионов была 7,8-8,0. Затем на каждый килограмм фарша добавляют 150,0-170,0 г измельченной поджелудочной железы свиньи или 18,0-20,0 г панкреатина и на каждый дм 3 смеси 10 см 3 хлороформа. Ферментативное расщепление должно продолжаться 5-6 сут при 40-45 С. Химические показатели качественного перевара общий азот 800,0-1200,0 мг аминный азот - 500,0-750,0 мг триптофан - 100,0-150,0 мг. Содержание (мг) общего азота определяют методом перегонки Къельдаля аминного азота (мг) - формольным титрованием триптофана (мг) - методом Пешкова. Приготовление печеночного экстракта. На 400,0 г свежей или свежезамороженной печени к. р. с. или свиней, освобожденной от жира и пленок,измельченной на кусочки по 30,0-50,0 г добавляют 5,0 см 3 дистиллированной воды и кипятят в течение часа, после чего фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Приготовление питательной среды. Для приготовления питательной среды к надосадочной жидкости основного перевара Хоттингера добавляют дистиллированную воду с таким расчетом, чтобы содержание аминного азота было не менее 200 -250 мг. Затем добавляют 10 печеночного экстракта, 0,4 пептона, 3-4 агара. Смесь кипятят в течение 30 минут, затем устанавливают рН среды до 7,7-7,8 путем добавления 20 едкого натра, добавляют 15 дистиллированной воды на выкипание, после чего добавляют 0,3 химически чистого хлорида натрия. После растворения указанных ингредиентов добавлением 20 едкого натра устанавливают рН 7,8-9,0. Среду кипятят 30 минут, отстаивают 11,5 часа, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. В каждую емкость со средой наслаивают стерильной вазелиновое масло Для контроля стерильности приготовленную питательную среду засевают на питательные среды МПА, МПБ, МППБ. Готовая питательная среда должна быть стерильной,прозрачной или слегка опалесцирующей, рН 7,4-7,6 и содержать аминный азот 200,0-250,0 мг. Приготовление посевного материала. Для изготовления антигена для получения вакцинных препаратов против некробактериоза животных каждый раз используют отдельную запаянную пробирку с нативной культурой. Каждый раз проверяют морфологические, культуральные и биохимические свойства и антигенные свойства штаммаВ-0185. Запаянную пробирку с нативной культуройвскрывают и добавляют в нее 2,0 см 3 стерильного физиологического раствора. Полученную взвесь заливают по 1,0 см 3 в два флакона с бульоном по Хоттингеру (вместимость флакона 100,0 см 3 , объем среды - 1/3 флакона). Выращивают в термостате 20-24 часа при температуре(культура первой генерации). Культуру первой генерации проверяют на чистоту микроскопией мазков, окрашенных по Граму, типичность роста, стерильность и засевают 50,0 см 3 в бутыль, содержащую 100,0 см 3 бульона по Хоттингеру(культура второй генерации). Культивирование проводят при (371,0)С 20-24 часа. Культура второй генерации служит посевным материалом для получения в последующем биомассы. Выращенную и проверенную на чистоту суточную матриксную культуру второй генерации с соблюдением условий стерильности засевают в бутыли со стерильной питательной средой,охлажденной до 37-30 С из расчета 5-10 матриксной расплодки к общему объему питательной среды, одновременно добавляют 0,1(в перерасчете на сухое вещество) стерильного 40 раствора глюкозы 5 -10 . Культуру, засеянную в бутыли, выращивают 2448 часов при(371,0)С с постоянным перемешиванием при (371,0)С. В процессе выращивания культуры через 18-20 часов после засева берут пробу для определения рН, чистоты роста и концентрации микробных тел. Добавляют 40 раствор глюкозы и продолжают выращивать еще в течение 4 -24 часов. Использование штамма в запаянной пробирке с нативной культурой бактерии В-0185 позволит получить иммуногенные антигены для изготовления вакцинных препаратов при некробактериозе рогатого скота. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм бактерии 0185, депонированный в лаборатории генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научноисследовательский ветеринарный институт, под номером -016, используемый для изготовления вакцины против некробактериоза крупного рогатого скота.

МПК / Метки

МПК: C12N 1/20

Метки: крупного, скота, против, изготовления, штамм, используемый, вакцины, некробактериоза, necrophorum, рогатого, fusobacterium, бактерии, в-0185

Код ссылки

<a href="http://kzpatents.com/4-ip27907-shtamm-bakterii-fusobacterium-necrophorum-v-0185-ispolzuemyjj-dlya-izgotovleniya-vakciny-protiv-nekrobakterioza-krupnogo-rogatogo-skota.html" rel="bookmark" title="База патентов Казахстана">Штамм бактерии fusobacterium necrophorum в-0185, используемый для изготовления вакцины против некробактериоза крупного рогатого скота</a>

Похожие патенты