Скачать PDF файл.

Формула / Реферат

РЕФЕРАТ
Изобретение относится к области генетической инженерии, молекулярной и сельскохозяйственной биотехнологии.
Полученный штамм-продуцент позволяет получить ферментный препарат, применяемый в качестве кормовой добавки для сельскохозяйственных животных.
Путем клонирования гена аррА из Escherichia coli в составе плазмидного вектора рАррА и трансформации данной генетической конструкцией клеток Escherichia coli ArcticExpress(DE3)RP/pAppA создан штамм-продуцент рекомбинантной фитазы АррА. Штамм-продуцент Escherichia coli ArcticExpress(DE3)RP/pAppA при индукции изопропил-P-Dl-тиогалактопиранозидом осуществляет внутриклеточное накопление рекомбинантного белка АррА. Выделение и очистка белка АррА проводится ферментативным лизисом клеточной стенки клеток рекомбинантного штамма с последующей очисткой целевого белка методами метало-аффинной хроматографии за счет наличия в белке метал-связывающего домена. Полученный и очищенный фермент обладает фосфогидролазной активностью в отношении фитина (мио-инозитолгексакисфосфат) и его производных с образованием инозитола и остатков фосфорной кислоты.
Ферментативная активность полученного белка АррА определялась фотометрическим методом, основанным на определении содержания неорганических фосфатов, образующихся в результате действия фермента фитазы на субстрат - фитат натрия. Активность рекомбинантной фитазы АррА составила 24000. Выход рекомбинантного фермента фитазы АррА составляет 12 мг с 1 литра индуцированной бактериальной культуры Escherichia coli ArcticExpress(DE3)RP/pAppA.

Текст

Смотреть все

(51) 12 15/52 (2006.01) 12 1/21 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ трансформации данной генетической конструкцией клеток(3)/ создан штамм-продуцент рекомбинантной фитазы АррА. Штамм-продуцент(3)/ при индукции изопропил 1-тиогалактопиранозидом осуществляет внутриклеточное накопление рекомбинантного белка АррА. Выделение и очистка белка АррА проводится ферментативным лизисом клеточной стенки клеток рекомбинантного штамма с последующей очисткой целевого белка методами метало-аффинной хроматографии за счет наличия в белке метал-связывающего домена. Полученный и очищенный фермент обладает фосфогидролазной активностью в отношении фитина(миоинозитолгексакисфосфат) и его производных с образованием инозитола и остатков фосфорной кислоты. Ферментативная активность полученного белка АррА определялась фотометрическим методом,основанным на определении содержания неорганических фосфатов,образующихся в результате действия фермента фитазы на субстрат фитат натрия. Активность рекомбинантной фитазы АррА составила 24000. Выход рекомбинантного фермента фитазы АррА составляет 12 мг с 1 литра индуцированной бактериальной культуры(3)/.(72) Абельденов Сайлау Касенович Силаев Дмитрий Витальевич Кириллов Савелий Олегович Кирибаева Асель Калиаскаровна Раманкулов Ерлан Мирхайдарович Хасенов Бекболат Бауржанович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(57) Изобретение относится к области генетической инженерии, молекулярной и сельскохозяйственной биотехнологии. Полученный штамм-продуцент позволяет получить ферментный препарат, применяемый в качестве кормовой добавки для сельскохозяйственных животных. Путем клонирования гена аррА изв составе плазмидного вектора рАррА и Изобретение относится к области генетической инженерии, молекулярной и сельскохозяйственной биотехнологии. Созданный штамм-продуцент позволяет получить ферментный препарат, применяемый в качестве кормовой добавки для сельскохозяйственных животных. С помощью рекомбинантного штамма(3)/ получена фосфогидролаза АррА (КФ 3.1.3.26). Штамм-продуцент получен на основе штамма(3) путем их трансформации оригинальным плазмидным вектором рАррА, несущим полноразмерный ген аррА. Изобретение позволяет получить рекомбинантный белок АррА до 24000 единиц, что соответствует 12 мг очищенного белка из 1 литра среды,обладающего фосфогидролазной активностью в отношении фитина(миоинозитолгексакисфосфат) и его производных с образованием инозитола и остатков фосфорной кислоты. Фосфогидролазы, в зависимости от оптимальной для ферментативной активности, кислотности среды разделяют на два класса кислые и щелочные. Кислые фосфогидролазы показывают наибольшую активность при 2,5-5,5, в то время как щелочные фосфогидролазы более активны при 7-8. В группе кислых фосфогидролаз выделяются бактериальные и грибные ферменты ( М.,.,1999). Бактериальные кислые фосфогидролазы демонстрируют более высокую удельную активность по сравнению с грибными из всех изученных к настоящему времени ферментов самую высокую удельную активность демонстрируют гидролазы выделенные изи, имеющие активность 2000 и 2072 ед./мг белка соответственно( Н.,Н., 2007). Первоначально, белок АррА, выделенный из периплазматического пространства бактерии, был описан как кислая фосфатаза( Е.,., 1985). Позже, была установлена бифункциональность данного фермента, за счет наличия еще и высокой фитазной активности ( .,.,., , 2000). В данной работе достаточно подробно охарактеризованы физико-химические и ферментативные свойства белка АррА. Были также предприняты попытки изменить такой важный параметр как термостабильность фермента путем модификации аминокислотной последовательности белка ( .,.,М., 2010). Причем установлено, что в обеспечении термостабильности важную роль играет С-конец белка ( В.,., Н., 2013). Высокая активность бактериальной фосфогидролазы АррА заинтересовала исследователей и, наряду с грибнойиз, АррА была экспрессирована в рапсе с целью получения генетически модифицированных растений,обогащенных гетерологичными фитазами, имеющими гораздо 2 большую активность, чем растительные ( ., .,.,., 2013). Другая бактериальная фосфогидролазаиз, в отличии от АррА из, демонстрирует максимальную активность в более щелочной среде (при рН 7,0-8,0). Это означает,что фермент должен функционировать не в желудке, как АррА, а в тонком кишечнике (где происходит поглощение фосфата),при таких же значениях не ингибируется неорганическим фосфатом и устойчива к протеолитическим ферментам (- М.,- . 2010). Однако, как было установлено, наличие фитатов в пище животных оказывает ингибирующее действие на протеолитические ферменты пепсин, трипсин, и фитаза, имеющая оптимум активности при кислом значении(т.е в желудке), является более предпочтительней чем щелочная. В целом кислая бактериальная фосфогидролаза АррА, имеющая высокую удельную активность и удачное сочетание других промышленно ценных свойств, рассматривается как одна из наиболее перспективных фитаз,для получения рекомбинантных продуцентов кормовых ферментов( , 2011). Патентный поиск среди изобретений,направленных на получение фитаз, выявил ряд интересных работ по продукции рекомбинантных фитаз в бактериальной и дрожжевой экспрессионных системах. Наиболее близким для данного изобретения является разработка технологии по получению гетерологичных белков,обладающих фитазной активностью, в дрожжевых системах (Патент США 20130244303). В этой работе описана дрожжевая система с повышенной экспрессией фитазного гена аррА в гетерологичном для нее окружении. В частности, был получен рекомбинантный фермент с фитазной активностью и повышенной термостабильностью. Ген бактериальной фитазы АррА был клонирован в хромосомную ДНКс использованием челночного вектора. Фермент имел оптимальную активность при температурном диапазоне 57 С 65 С и приот 2,5 до 3,5. Изобретение представляет собой дрожжевую клеточную систему,несущую гетерологичный ген, который кодирует белок с фитазной активностью, и который функционально связан с промотором, способного экспрессировать фитазу в дрожжах. Исследователям удалось получить фермент, секретируемый в среду. Данный фермент был сшит с сигнальной последовательностью, способной транспортировать целевой белок из клетки сквозь клеточную стенку,что облегчило очистку продукта. Еще одной особенностью работы является то, что дрожжевой экспрессионный штамм является метилотрофным,т.е. штаммом способным к утилизации метанола в качестве источника углерода необходимого для клеточного функционирования. Также,рекомбинантный фермент сохранял фитазную активность на уровне 40 после прогревания фермента в течение 15 минут при 80 С и 60 фитазной активности после прогревания фермента в течение 15 минут при 60 С. В работе использовались челночные вектора, имеющие точку начала репликации, способную к репликации в бактериальной клетке, что облегчает процедуру клонирования гена.Ои др. (Патент США 79683422) получили рекомбинантную фитазу. АррА с модифицированными аминокислотными последовательностями,что привело к улучшению фитазных характеристик. В данной работе был проведен мутагенезный скрининг фитаз на поиск белков с улучшенными физико- и биохимическими характеристиками,таких как повышенная термостабильность,повышенная специфическая активность в отношении фитиновой кислоты и ее производных и рабочее значениеблизкое к физиологическим показателям свиней. Проведенные нуклеотидные замены привели изменению аминокислотной структуры белка АррА, что в свою очередь сказалось на функциональных характеристиках рекомбинантной фитазы. Экспрессию гена фитазы проводили в клетках, что дает весьма привлекательную перспективу в плане использования в промышленности.с соавторами (Патент США 20120021488) клонировали ген фитазы АррА из штамма-12, провели кодон оптимизацию и экспрессию в дрожжевых системах,. Была получена термотолерантная фитаза с помощью ферментирования вышеперечисленных дрожжей, несущих ген фитазы. Используя преимущества метода рекомбинантных ДНК,кодоны для ряда аминокислот с низкой частотой встречаемости (10) были заменены на кодоны с большей частотой. Оптимальный диапазон кислотности, при которой очищенная фитаза демонстрировала высокую активность составила 3-6. Оптимальная температура составила 55 С. Вышеуказанное показывает перспективность работ по получению рекомбинантной фитазы АррА в микроорганизмах. Недостатками вышеперечисленных разработок является либо невысокий уровень экспрессии гена бактериальной фитазы, либо невысокая ферментативная активность фитазы. Невысокий уровень экспрессии в дрожжах связан с особенностью секреторной системы экспрессии и с особенностью метаболизма данных микроорганизмов. И, в данном контексте,бактериальная система экспрессии с внутриклеточным накоплением белка имеет преимущество,так как,внутриклеточное накопление белка в бактериях выше, чем секреторная экспрессия в дрожжах. Сравнение количественных показателей по фитазной активности показывает, что АррА изимеет гораздо большую активность в сравнении сизииз, а использование технологии рекомбинантных ДНК с использованием плазмидной экспрессии гена под сильным фаговым промотором позволяет получить в той же кишечной палочке гораздо больше рекомбинантного фермента АррА. Преимущество предлагаемого в данном изобретении штамма(3) заключается в том, что в генотипе (3) имеются встроенные гены шаперонов психофильной бактерииСр 10 и Ср 60. Присутствие данных белков позволяет добиться 30 фолдирующей активности при 12 С и достигает максимума при температуре 30 С. Для предотвращения утери плазмидной ДНК в экзонуклеазуданного штамма введена соответствующая мутация. Для снижения деградации белков в геноме (3) устранены протеазы (ОрТ мутация). Использование данного штамма вкупе с плазмидным вектором рАррА позволяет получать белок АррА с высокой ферментативной активностью до 24000 единиц (12 мг из 1 литра среды),обладающий фосфогидролазной активностью в отношении фитина и его производных. Задачей изобретения является создание рекомбинантного штамма(3)/,продуцирующего фитазу АррА. Задача достигается в три этапа Этап 1. Создание генно-инженерной конструкции рАррА, содержащей полноразмерный ген бактериальной фитазы аррА. Ген аррА был амплифицирован с геномной ДНК 21(3) с использованием специфичных гену праймеров - (53),(53). Далее, ген был клонирован в экспрессионный вектор рЕТ-28 с с использованием ферментов нуклеинового обмена. Для трансформации применяли высококомпетентные клетки ТОР 10. Отбор колоний-трансформантов проводился на твердой питательной среде с антибиотиком канамицином. Подтвержденные колонии инокулировали в 5 мл ЛБ-бульона, выделяли плазмидную ДНК по протоколу минипреп. Секвенирование проводили с использованием праймеров Т 7, фланкирующих регион с вставкой и олигонуклеотидов специфичных к внутренним регионам гена для полного его перекрытия (53), - (5 С-3),-240(5-3), -501 (5-3), -821 (5-3), 1101 (53). В результате, получен плазмидный вектор рАррА в котором ген аррА встроен под контроль индуцируемого изопропил 1 тиогалактопиранозидом промотора РНК полимеразы бактериофага Т 7. Полученная генетическая конструкция позволяет получить белок на 445 аминокислотных остатков 3. Расчетная молекулярная масса белка АррА составляет 48,5 кДа. Этап 2. Создание рекомбинантного штамма(3)/,содержащего и экспрессирующего ген фитазы аррА. Полученным вектором рАррА были трансформированы клетки штамма(3). Трансформацию проводили методом электропорации. Отбор трансформантов проводили на твердой агаризованной среде с канамицином в качестве селективного маркера. Колонии рекомбинантного штамма инокулировали в 50 мл ЛБ-бульона и культивировали в течение 8 часов при температуре 37 С и встряхивании 150 об/мин. По достижении середины логарифмической фазы роста отбирали по 10 мл каждой культуры в качестве нулевой точки и добавляли ИПТГ в концентрации 0,5 мМ. Инкубацию с активатором индукции проводили в течение 16 часов при тех же условиях. По окончании инкубации повторно собирали по 10 мл культуры. Клетки собирали центрифугированием(4 С, 6000, 7 мин), лизировали ультразвуком. Полученный лизат разделяли высокоскоростным центрифугированием на водорастворимую и водонерастворимую фракции. В дальнейшем,полный лизат и полученные фракции подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях для оценки уровня экспрессии. Для дальнейшей работы была отобрана колония с максимально высоким уровнем накопления белка АррА. Полученный штамм-продуцент(3)/ характеризуется следующими признаками Среда, температура, возраст, условия роста среда, 37 С, 120 , 16 ч. Морфологические признаки палочки 1,1-6 мкм, грамотрицательные,спор и цисты не образует, кислотонеустойчивы,подвижны за счет перитрихиальных жгутиков. Условия хранения на криосохранении при -80 С в 50 -среде и 50 глицерине, концентрация клеток 109 колониеобразующих единиц в 1 мл среды, лиофильно высушенные образцы - при температуре 4 С, -20 С, -40 С и -80 С в течение 10 лет, криоконсервированные образцы - при температуре хранения -80 С, в течение 10 лет. Культуральные признаки при росте на агаризованной средеколонии округлые, с 4 ровными краями, консистенция мягкая, с блеском. Диаметр колоний 1 мм, цвет поверхности - светлокоричневый. Рост в жидкой среде сопровождается появлением резкого запаха, помутнением среды. Физиолого-биохимические признаки температурный оптимум для роста клеток 30 С 37 С, оптимум 7,2-7,4, тип размножения бинарное деление, агрегаты клеток - одиночные или парами. Устойчивость к антибиотикам клетки проявляют устойчивость к гентамицину и канамицину,обусловленную наличием в хромосомной ДНК гена, а в плазмиде гена . Принадлежность к трофической группе хемогетеротроф. Тип катаболизма дыхание, брожение. Отношение к кислороду факультативный анаэроб. Размер генома, наличие и характеристика плазмид Генотип - орТ (- -)(3)10 ср 60. Содержит плазмиду(6544 п.н.). Дифференцирующие компоненты клеточной стенки индол, ацетилметилкарбинол (ацетоин),лимонная кислота, лактоза. Дифференцирующие антигены О- и К-антигены. Полученный штамм-продуцент(3)/ депонировали в Депозитарии ТОО Казахский научноисследовательский институт перерабатывающей и пищевой промышленности,регистрационный номер, присвоенный коллекцией В-494. Этап 3. Выделение белка и проверка активности. Рекомбинантный белок АррА после лизиса индуцированных клеток(3)/ при помощи фермента лизоцима(2 мг/мл) и ультразвукового соникирования, присутствует в водорастворимой и водонерастворимой фракциях, где АррА агрегирует в тельца включения. Из водорастворимой фракции очистку проводили методом металлоаффинной хроматографии с использованием колонки 1 и препаративного хроматографа АКТА 10. Для хроматографической очистки белка индуцированную культуру нарабатывали в объеме 400 мл. Клетки собирали центрифугированием на препаративной центрифуге с использованием ротора 10 при следующих условиях 6000, 4 С, 7 мин. Осажденные таким образом мокрые клетки были ресуспендированы в 12 мл буфере 20 мМ , 20 мМ - ( 7,5) из расчета 5 мл буфера на 1 грамм мокрых клеток. Полученная суспензия была заморожена при температуре -20 С, оттаяна и повторно заморожена для увеличения эффективности лизиса. После вторичного оттаивания клетки лизировали методом ультразвукового соникирования в импульсном режиме в течение 40 минут. При лизисе был добавлен ингибитор сериновых протеаз фенилметансульфонилфлуорид в финальной концентрации 0,2 мМ для ингибирования сериновых протеаз. Далее лизат центрифугировали на центрифугес использованием ротора 20 при следующих условиях 40000, 4 С в течение 1 часа. Осветленный,таким образом,водорастворимый лизат наносили на колонку,предварительно активированную ионами 2. Элюцию рекомбинантного белка проводили градиентом по имидазолу от 20 мМ до 500 мМ с использованием следующих буферов А (500 мМ- с 7,5). Требуемый белок АррА элюировал с колонки при концентрации имидазола 135 мМ - 185 мМ. Измерение молекулярной массы выделенного белка проводилось электрофорезом в полиакриламидном геле, содержащем додецил сульфат натрия по протоколу, описанному Лэммли( ., 1970). Масса белка соответствовала расчетной (48,5 кДа). Концентрация белка определялась колориметрическим методом по Бредфорду с использованием белка бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта( М., 1976). Ферментативная активность полученного белка АррА определялась фотометрическим методом,основанным на определении содержания неорганических фосфатов,образующихся в результате действия фермента фитазы на субстрат фитат натрия согласно ГОСТ 53360-2009. Активность полученной рекомбинантной фитазы составила 6052 единицы на 1 мл очищенной фракции или 3271 единица на 1 мг белка. Суммарно,активность выделенной рекомбинантной фитазы АррА составила 24000 единиц. Выход рекомбинантного фермента фитазы АррА составляет 12 мг с 1 литра индуцированной бактериальной культуры(3)/,продуцирующий фитазу АррА. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Рекомбинантный штамм(3)/,депонирован в Депозитарии ТОО Казахский научноисследовательский институт пищевой и перерабатывающей промышленности под регистрационным номером В-494, продуцирующий фосфогидролазу АррА.

МПК / Метки

МПК: C12N 1/21, C12N 15/52

Метки: escherichia, штамм, арра, фосфогидролазу, рекомбинантный, продуцирующий

Код ссылки

<a href="http://kzpatents.com/5-30999-rekombinantnyjj-shtamm-escherichia-coli-arcticexpressde3rp-pappa-produciruyushhijj-fosfogidrolazu-arra.html" rel="bookmark" title="База патентов Казахстана">Рекомбинантный штамм Escherichia coli ArcticExpress(DE3)RP/pAppA, продуцирующий фосфогидролазу АррА</a>

Похожие патенты