Скачать PDF файл.

Формула / Реферат

Изобретение относится к области медицинской иммунобиологии, может быть использовано при изготовлении сибиреязвенной вакцины против сибирской язвы людей и сельскохозяйственных животных.
Технический результат, обеспечиваемый изобретением, выражается в изыскании высокоиммуногенного штамма сибирской язвы, для использования при изготовлении вакцины против сибирской язвы людей.
Штамм бактерии Bacillus anthracis В - 191, депонирован в Республиканской коллекции и депозитарии особо - опасных микроорганизмов с музеем живых культур Республиканского государственного казенного предприятия «Казахский научный центр карантинных и зоонозных инфекций имени Масгута Айкимбаева», перспективный в качестве вакцинного.

Текст

Смотреть все

(51) 61 39/07 (2006.01) 12 1/20 (2006.01) 12 1/07 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ ЛЮДЕЙ(57) Изобретение относится к области медицинской иммунобиологии, может быть использовано при изготовлении сибиреязвенной вакцины против сибирской язвы людей и сельскохозяйственных животных. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в изыскании высокоиммуногенного штамма сибирской язвы, для использования при изготовлении вакцины против сибирской язвы людей. Штамм бактерииВ - 191,депонирован в Республиканской коллекции и депозитарии особо - опасных микроорганизмов с музеем живых культур Республиканского государственного казенного предприятия Казахский научный центр карантинных и зоонозных инфекций имени Масгута Айкимбаева,перспективный в качестве вакцинного.(72) Лухнова Лариса Юрьевна Сагатова Мадиша Ескеновна Пазылов Ерлан Куттыбаевич Избанова Уйнкуль Айтеновна Сармантаева Акмарал Бостандыковна Бегимбаева Эльмира Жуазбаевна Мека-Меченко Татьяна Владимировна Некрасова Лариса Евгеньевна Казаков Владимир Станиславович(73) Республиканское государственное казнное предприятие Казахский научный центр карантинных и зоонозных инфекций им. Масгута Айкимбаева Агентства Республики Казахстан по защите прав потребителей 30758 Изобретение относится к области медицинской иммунобиологии, может быть использовано при изготовлении сибиреязвенной вакцины против сибирской язвы людей. Известен штамм бактерии,используемой для изготовления вакцины сибиреязвенной СТИ живой сухой, выпускаемой Научно-исследовательским институтом Министерство Обороны Российской Федерации Бургасов П.Н. с соавторами // Журнал микробиология, эпидемиология и иммунология. 1976 - С. 27-35. Известна вакцина сибиреязвенная СТИ живая сухая, выпускаемая Научно-исследовательским институтом Министерство Обороны Российской Федерации, г. Киров. Недостатком живой вакцины является длительный латентный период и период нарастания(до 3-4 недель), относительно короткий период высокой специфической резистентности, что проявляется пробоем иммунитета в первые 514 суток и через 3 месяца после иммунизации, при этом из всех заболевших сибирской язвой от 6,4 до 27,7 составляли люди, ранее привитые живой вакциной. Задачей изобретения является создание вакцины для высокой и длительно сохраняющейся специфической невосприимчивости у человека или животного к возбудителю сибирской язвы. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в изыскании высокоиммуногенного штамма сибирской язвы, для использования при изготовлении вакцины против сибирской язвы людей. Штамм бактерииВ-191 депонирован в Республиканской коллекции и депозитарий особо-опасных микроорганизмов с музеем живых культур Казахский научный центр карантинных и зоонозных инфекций имени Масгута Айкимбаева, используемый для изготовления вакцины против сибирской язвы людей. Идентификацию штамма бактерииВ-191 проводят по морфологическим,культуральным и генетическим признакам. Происхождение штамма бактерии. Штамм бактерии выделен в Восточно-Казахстанской области, селе Знаменка 02 июля 2004 году из пробы крови больного сибирской язвой человека. Способ выделения - агар Хоттингера, бульон Хоттингера и отбор колоний в -форме. Идентифицирован согласно определителю бактерии,2005., . . 370 - 386. Сравнен с типовыми коллекционными штаммамиСТИ (вакцинный,безкапсульный),1 (типичный,капсульный). Назначение штамма бактерии. Штамм типовой,используемый для приготовления сухой формы сибиреязвенной аттенуированной вакцины. У штаммаВ-191 отсутствует 2 плазмида вирулентности рХ 2, кодирующая синтез генаи продукцию капсульной субстанции. Состав среды и условия для культивирования агар Хоттингера состоящий из 2,3 агар-агар,0,57 г/л двузамещенного безводного натрия. Т 3738 С, -7,6. Морфолого культуральные свойства. Возбудитель сибирской язвы прямая грамположительная палочка, в мазках палочки располагаются короткими цепочками или попарно,концы их, обращенные друг к другу, резко обрублены, свободные концы обычно закруглены. Возбудитель сибирской язвы лишен жгутиков и неподвижен. Образует спору и капсулу. Возбудитель сибирской язвы растет на агаре Хоттингера при температуре 37 С - 38 С,-7,6. Через 24 часа культивирования в термостате накопление бактериальной массы составляло более 2000 миллиардов микробных клеток в 1,0 см 3. При повторной проверке выбранного штаммаВ-191, через 3 месяца после хранения на агаре Хоттингера под резиновыми пробками, была установлена его стабильность в быстроте роста и его свойств, что указывало на целесообразность его использования для создания вакцины против сибирской язвы людей и сельскохозяйственных животных. Физиолого-биохимические свойства. Принадлежность к трофической группе хемоорганотроф. Типы катабализма факультативный анаэроб. Симбиотрофные отношения паразитизм. Источники углерода глюкоза, глицерин. Антигенная структура. У штаммаВ-191 отсутствует плазмида вирулентности рХО 2, кодирующая синтез генаи продукцию капсульной субстанции. Маркерные признаки. Гемолизнегативный,отсутствуют ферменты фосфатаза, лецитиназа,лизирует сибиреязвенный бактериофаг,положительный тест жемчужное ожерелье. Штамм имеет плазмидный ген . Серологические свойства. В сыворотках лабораторных животных(кролики),иммунизированных штаммомВ 191, выявляют специфические сибиреязвенные антитела на 10-12 сутки в титрах 140 - 180. Патогенные свойства. Вирулентность снижена, для кроликов 109 м.к./мл, для белых мышей 107 м.к./мл. Способ, условия и состав сред для хранения. Основные биологические свойства штамма стабильно сохраняются при многократных пассажах через организм лабораторных животных и при пересевах на питательных средах (агар Хоттингера) при температуре 37 С - 38 С,-7.6, срок наблюдения 10 лет. Способ, условия и состав сред для размножения штамма агар Хоттингера состоящий из 2,3 агар агар, 0,57 г/л двузамещенного безводного натрия. Молекулярно-биологические характеристики штаммаВ-191. 30758 Молекулярно-биологические характеристики штаммаВ-191, выражаются в нуклеотидных последовательностях,электрофореграмме и дендрограмме. Пример 1. Постановка ПЦР для выявления генов, . При исследовании В -191 штамма в полимеразной цепной реакции (ПЦР) выявлены ген, характерный для возбудителя сибирской язвы,обуславливающий иммуногенные свойства штамма. Молекулярная масса плазмиды 1 составляет 110 МД. У штамма отсутствует ген,обуславливающие вирулентные свойства. Для постановки ПЦР подготовку штаммовдля выделения ДНК проводили по следующей методике Штаммывыращивали в бульоне Хоттингера в течение 18-24 часов при 37 С. Через 24 часа 0,1 мл бульонной культуры засевают в 0,4 мл бульона Хоттингера, пробирки инкубируют при 37 С в течение 2,5 часов. В каждую пробирку добавляют 500 ед. пенициллина и инкубируют в тех же условиях еще 15 минут, после чего кипятят при 100 С в течение 10 минут. Для контроля стерильности делают высевы на агар Хоттингера. Затем центрифугируют при 8000 об/мин.,надосадок используют для выделения ДНК. Для выделения ДНК использовали набор. После чего готовят лизат клеток с протеиназой К и буфером . После инкубирования при 56 С в течение 10 минут, центрифугируют добавляют в надосадочный раствор этанол. Смесь переносят в специальную фильтрующую колонку. Работу продолжают с содержимым колонки. Последовательно содержимое колонки смешивают с буферами 1, 2, АЕ, центрифугируя смесь после каждого добавления буфера. После добавления буфера АЕ фильтрат сохраняется и с этой порцией готовят реакционную смесь. Реакционную смесь готовят с использованием набора -(0,2 мл пробирки с крышками), производитель, предназначенных для проведения реакции в объеме 25 мкл. Для проведения полимеразной цепной реакции используют- т- полимеразу - фермент, обеспечивающий достраивание второй цепи ДНК- смесь дНТФ, дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФстроительный материал, из которого синтезируется достраиваемая ферментомцепь ДНК- буферсмесь катионов и анионов в определенной концентрации,обеспечивающих оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН). Для обнаружения гена , кодирующего синтез плазмиды 1 использовали праймеры 1 - 5, САР А, САР В, САР С. Праймеры для определения 1 и рХ 2 плазмид произведены на фирме. Последовательность нуклеотидов для определения генови ,кодируюемые плазмидами,рХО 2 представлены в таблице 1. Из таблицы 1 видно последовательность нуклеотидов у праймеров ,САР. Для проведения амплификации использовали термоциклер РТС 200 ( ) со следующими циклами 94 С - 5 мин однократно 94 С - 1 мин 55 С- 30 сек 30 раз 72 С - 30 сек 72 С - 5 мин однократно В качестве отрицательного контроля применяли ДНК, положительного контроля ДНК вакцинного штамма СТИ-1. Для контроля отсутствия контаминации исследуемых образцов,вместо ДНК в пробирку добавляли 1 мкл дистиллированной воды. После проведения ПЦР в каждую пробирку добавляют 10 от объема реакции установочного буфера с красителем (0,02 ксиллен цианол, 0,02 бромфенол синий и 50 глицерина) перемешивают,и 10 мкл окрашенного образца вносили в лунки 2 ого агарозного геля. Электрофорез проводят в 0,5 х ТБЕ буфере в течение 45 минут при напряжении равным 120 В, с последующей окраской раствора этидиум бромида для визуализации результатов при ультрафиолетовом облучении. Для определения размера и веса фрагментов ДНК в крайнюю лунку добавляли 4 мкл низкомолекулярного ДНК маркера(2000 р (пар нуклеотидов), 1200 р, 800 р, 400 р,200 р, 100 р). Электрофорез проводят в 0,5 х ТБЕ буфере в течение 45 минут при напряжении равным 120 В, с последующей окраской раствора этидиум бромида для визуализации результатов при ультрафиолетовом облучении. Для определения размера и веса фрагментов ДНК в крайнюю лунку добавляли 4 мкл низкомолекулярного ДНК маркера(2000 р (пар нуклеотидов), 1200 р, 800 р, 400 р,200 р, 100 р). Анализ продуктов амплификации методом электрофореза в агарозном геле учитывают в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе Трансиллюминатор. Фотографирование и анализ геля, после электрофореза проводили с применением - ,1(, ). Результаты ПЦР со штаммомВ 191 при использовании праймера 1 показан на фиг.1, в котором штаммВ -191 имеет плазмиду 1, ген . Расчет молекулярного веса амплифицированных фрагментов ДНК штаммаВ-191 проведен с помощью программы 1 . Из таблицы 2 представлены размеры амплифицированных фрагментов генау штаммаВ 191. При постановке ПЦР со штаммомВ-191 с использованием праймера Сар А был получен отрицательный вариант (фиг.2), при 3 30758 этом у штаммаВ 191 отсутствует плазмида рХО 2 (плазмида вирулентности), ген . Пример 2. Проведено молекулярное типирование - мультилокусный анализ ( - 8) штаммаВ - 91. Мультилокусный анализ ( - -) это метод типирования штаммов с использованием хромосомных и плазмидных маркеров. Мультилокусный анализ предназначен для внутривидовой и внутриродовой дифференциации штаммов В. , выявления плазмидных и хромосомных генов, определения генотипов. Выделение ДНК проводят по следующей методике- через 24 часа 0,1 мл бульонной культуры засевают в 0,4 мл бульона Хоттингера, пробирки инкубируют при 37 С в течение 2,5 часов- в каждую пробирку добавляют 500 ед. пенициллина и инкубируют в тех же условиях еще 15 минут, после чего кипятили при 100 С в течение 10 минут- для контроля стерильности делали высевы на агар Хоттингера- затем центрифугируют при 8000 об/мин.,надосадок используют для выделения ДНК. Для выделения ДНК используют набор. Готовят лизат клеток с протеиназой К и буфером . После инкубирования при 56 С в течение 10 минут, центрифугируют и добавляют в надосадочный раствор этанол. Смесь переносят в специальную фильтрующую колонку. Работу продолжают с содержимым колонки. Последовательно содержимое колонки смешивают с буферами 1, 2, АЕ, центрифугируя смесь после каждого добавления буфера. После добавления буфера АЕ фильтрат сохраняется и с этой порцией готовят реакционную смесь. Реакционную смесь готовят с использованием набора -(0,2 мл пробирки с крышками), производитель, предназначенных для проведения реакции в объеме 25 мкл. Для проведения полимеразной цепной реакции используют- т - полимеразу - фермент, обеспечивающий достраивание второй цепи ДНК- смесь дНТФ, дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ строительный материал, из которого синтезируется достраиваемая ферментомцепь ДНК- буфер - смесь катионов и анионов в определенной концентрации,обеспечивающих оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение). Для мультилокусного анализа использованы праймеры, синтезированные фирмой.. (2000) (, , 2, , 2,3, , 2). Все обратные праймеры несут 4 на 5 - конце флюоресцентную метку Су 5 для использования в автоматическом секвенаторе 310 фирмы(таблица 3). Таблице 3 представлены праймеры, используемые при изучении штамма В-191 в Л - 8 на аппарате-310 Л - 8 проводили на секвенаторе-310. Для проведения амплификации используют термоциклер РТС 200 ( ) со следующими циклами 94 С - 5 мин однократно 94 С - 1 мин 55 С- 30 сек 30 раз 72 С - 30 сек 72 С - 5 мин однократно. В качестве отрицательного контроля применяют ДНК, положительного контроля ДНК вакцинного штамма СТИ-1. Для контроля отсутствия контаминации исследуемых образцов,вместо ДНК в пробирку добавляют 1 мкл дистиллированной воды. После проведения ПЦР в каждую пробирку добавляют 10 от объема реакции установочного буфера с красителем (0,02 ксиллен цианол, 0,02 брофенол синий и 50 глицерина) перемешивают, и 10 мкл окрашенного образца вносят в лунки 2-ого агарозного геля. Электрофорез проводят в 0,5 х ТБЕ буфере в течение 45 минут при напряжении равным 120 В, с последующей окраской раствора этидиум бромида для визуализации результатов при ультрафиолетовом облучении. Для определения размера и веса фрагментов ДНК в крайнюю лунку добавляют 4 мкл низкомолекулярного ДНК маркера(2000 р (пар нуклеотидов), 1200 р, 800 р, 400 р,200 р, 100 р). Электрофорез проводят в 0,5 х ТБЕ буфере в течение 45 минут при напряжении равным 120 В, с последующей окраской раствора этидиум бромида для визуализации результатов при ультрафиолетовом облучении. Для определения размера и веса фрагментов ДНК в крайнюю лунку добавляют 4 мкл низкомолекулярного ДНК маркера(2000 р (пар нуклеотидов), 1200 р, 800 р, 400 р,200 р, 100 р). Анализ продуктов амплификации методом электрофореза в агарозном геле учитывают в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе Трансиллюминатор. Фотографирование и анализ геля, после электрофореза проводят с применением - ,1(, ). Результаты исследования штамма В-191 в Л- 8 свидетельствуют о том, что у штамма отсутствует плазмида рХ 2, ген , штамм имеет плазмиду рХО 1, ген(таблица 4). Таким образом, результаты исследования свидетельствуют об отсутствии у штамма плазмиды рХО 2 (плазмида вирулентности), гена ,кодирующего этой плазмидой. Штамм имеет плазмиду , ген . Использование штаммаВ - 191 позволит создать вакцину для высокой и длительно Последовательность нуклеотидов у праймеров , САР Последовательность нуклеотидов праймеров для выявления гена 1-1-2-2-3-3-4-4-5-5 Последовательность нуклеотидов праймеров для выявления гена р-В-В- Фиг.1 Результаты ПЦР - анализа со штаммомВ 191 (праймер 1). Таблица 2 Молекулярный вес амплифицированных фрагментов ДНК штаммаВ-191(праймер 1) Амплифицированные фрагменты штаммаВ -191 ( ) Фиг.2 Результаты ПЦР анализа со штаммомВ 191 (праймера Сар А). Примечание 65 соответствует штаммуВ 191. Таблица 3 Праймеры, используемые при изучении штамма В-191 в ЛА - 8 на аппарате-310 Таблица 4 Результаты генотипирования штаммаВ - 191 методом ЛА-8 Размеры хромосомных маркеров по числу Размеры плазмидных пар нуклеотидов (п.н.) маркеров по (п.н.)(ориентирово 308 224 154 616 598 147 126 чные данные) ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм бактерий, депонирован в Республиканской коллекции и депозитарии особо опасных микроорганизмов с музеем живых культур Казахский научный центр карантинных и зоонозных инфекций имени Масгута Айкимбаева под номером В-191, используемый для изготовления вакцины против сибирской язвы людей.

МПК / Метки

МПК: A61K 39/07, C12N 1/20, C12R 1/07

Метки: вакцины, людей, язвы, изготовления, штамм, anthracis, используемый, b-191, против, бактерии, bacillus, сибирской

Код ссылки

<a href="http://kzpatents.com/6-ip30758-shtamm-bakterii-bacillus-anthracis-b-191-ispolzuemyjj-dlya-izgotovleniya-vakciny-protiv-sibirskojj-yazvy-lyudejj.html" rel="bookmark" title="База патентов Казахстана">Штамм бактерии Bacillus anthracis B-191, используемый для изготовления вакцины против сибирской язвы людей</a>

Похожие патенты