Микробный препарат из штаммов микроорганизмов-деструкторов Acinetobacter calcoaceticum 18, Bacillus sp.20, Micrococcus roseus 25, Candida sp. 12/5, используемый для очистки почвы от загрязнения керосином Т-1

Скачать PDF файл.

Формула / Реферат

Изобретение относится к биотехнологии, экологии и может быть использовано для очистки почв от ракетного топлива. Микробный препарат из штаммов микроорганизмов-деструкторов Acinetobacter calcoaceticum 18, Bacillus sp. 20, Micrococcus roseus 25, Candida sp. 12/5 позволяет проводить очистку почвы от загрязнения керосином Т-1.

Текст

Смотреть все

(51) 12 1/00 (2006.01) 12 1/00 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(54) МИКРОБНЫЙ ПРЕПАРАТ ИЗ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ-ДЕСТРУКТОРОВ 18, .20,25, .12/5, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВЫ ОТ ЗАГРЯЗНЕНИЯ КЕРОСИНОМ Т-1(57) Изобретение относится к биотехнологии,экологии и может быть использовано для очистки почв от ракетного топлива. Микробный препарат из штаммов микроорганизмов-деструкторов 18,. 20,25,. 12/5 позволяет проводить очистку почвы от загрязнения керосином Т-1.(72) Жубатов Жайлаубай Арынов Кажмухан Тохтиярович Бимаганбетова Алма Орманбековна Бекешев Ерлан Ахмедович Кабулова Гулжиян Кахармановна Капанова Римма Исламовна Кусаинова Диана Нурлановна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский центр арыш-Экология Национального космического агентства Республики Казахстан Изобретение относится к биотехнологии,экологии и может быть использовано для очистки почв от ракетного топлива. Одна из проблем экологической безопасности территории Республики Казахстан связана с эксплуатацией космодрома Байконур. С космодрома осуществляются пуски ракетоносителей различного класса. Одним из факторов,отрицательно влияющих на экологическую обстановку при эксплуатации ракетно-космической техники, является загрязнение природных наземных экосистем токсичными компонентами ракетного топлива и продуктами его разложения. Ракетное топливо керосин Т-1 - горючая жидкость, получаемая путем перегонки или ректификации нефти. Известно, что нефть и нефтепродукты нарушают экологическое состояние почвенных покровов и в целом деформируют структуру биоценозов. С ростом темпов освоения космоса неизбежно возрастает риск экологического загрязнения окружающей среды, что делает актуальными разработки эффективных способов санации очагов техногенного загрязнения углеводородными соединениями. В настоящее время для очистки окружающей среды от нефтяных загрязнений используются биопрепараты на основе активно разлагающих нефть микроорганизмов бактерий родов, , , дрожжей , нитевидных актиномицетов , грибовии др. Имеются разнообразные биопрепараты,разработанные для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами Авалон, Бациспецин,Валентис, Деворойл, Достроил, Нафтокс, Никаойл,Петролан, Путидойл, Родер, Универсал и др.).(Демьяненко А.Ф.,Мизгирев Н.С. Микробиологическая очистка грунтов от нефтепродуктов в закрытых реакторах изотермического типа // Вестник ВНИИЖТ, 2005,6). Самыми известными из них и давно применяющимися на практике являются биопрепараты Путидойл (А.с. СССР 1076446, 1982 А.с. СССР 1428809, 1988 ТУ 64-16-75-91) и Деворойл (Патент 2023686). Недостатком препарата Путидойл является использование в его составе монокультуры бактерий, что снижает его эффективность. Существуют также публикации, указывающие на то,что он оказывает угнетающее воздействие на естественный микробный ценоз (Новиков Ю.В,Комзолова Н.В. Исследования бактериального препарата Путидойл, предложенного для очистки водоемов от нефти (Новиков Ю.В, Комзолова Н.В. Исследования бактериального препарата Путидойл, предложенного для очистки водоемов от нефти // Водное хозяйство. - 1992, - 2. - С. 121123). Наиболее близким решением является препарат Деворойл, содержащий в своем составе штаммы.,,,,,активно окисляющие нефтепродукты как в зоне контакта с водой, так и непосредственно в нефтяной пленке,способные утилизировать широкий диапазон углеводородов нефти. Недостатком препарата Деворойл является неприспособленность используемых в его составе микроорганизмов к местным условиям Центрального Казахстана в районах падения ОЧ ,в первую очередь к температурному и водному режиму, а также обеспечению доступа воздуха в очищаемую среду. Эффективная деструкция различных углеводородов микроорганизмами, внесенными в почву с препаратом, возможна лишь в тех случаях,когда они найдут в почве благоприятные условия для жизнедеятельности и развития (источники питания, необходимый тепловой и водный режимы,и т.д.). Это свидетельствует о целесообразности выделения микроорганизмов, адаптированных к условиям загрязнения и успешно утилизирующих нефтепродукты, что в свою очередь обеспечит наиболее эффективную очистку почв биологическими методами. Задача изобретения состоит в создании микробного препарата из штаммов микроорганизмов-деструкторов 18,. 20,25,. 12/5, используемого для очистки почвы от загрязнения керосином Т-1. Поставленная задача решается применением микробного препарата, включающего штаммы микроорганизмов 18, . 20,25,. 12/5. Микробный препарат представляет собой смесь природных нефтеокисляющих микроорганизмов,которые были выделены из почв, загрязненных ракетным топливом - керосином Т-1. Использование микробного препарата из штаммов микроорганизмов-деструкторов позволяет утилизировать углеводородное ракетное топливо керосин Т-1 в почве до 97 за 10 дней. Описание штаммов микроорганизмов, входящих в состав микробного препарата. Штамм 25 выделен из образца почвы Комплекс Байконур пл. 31 (0-50 см). Представляет собой кокки, одиночные, в парах и в скоплениях, 1,25-2,0 мкм. Грамположительные,некислотоустойчивые, спор не образуют. На МПА(мясо-пептонный агар) культура образует округлые,выпуклые колонии красного цвета, диаметром 1-2 мм. Край колоний ровный, пигменты в среду не выделяет. Аэроб. При росте в МПБ (мясопептонный бульон) происходит помутнение среды,выпадает осадок, на поверхности образуется кольцевидная пленка. В качестве источника углерода использует глюкозу, лактозу, маннозу. Крахмал не гидролизует, желатину не разжижает. Сероводород и индол не образует. Нитраты не менее 5.108 КОЕ/мл, срок хранения не менее 3 месяцев, в сухом - п. 1010 КОЕ/г, срок хранения 12 месяцев. По результатам испытаний на загрязненных керосином почвах установлена высокая эффективность препарата. Сущность изобретения поясняется поясняются следующими конкретными примерами. Пример 1. Штаммы микроорганизмов 18,. 20,25,. 12/5 выращивают на питательной среде следующего состава (г/л) пептон - 5,0 поваренная соль - 5,0 мясной экстракт- 1,5 дрожжевой экстракт - 1,567,40,2, вода 1 л. Жидкую питательную среду засевают упомянутыми исходными штаммами микроорганизмов (каждую отдельно) в количестве 5 смывом с косяков МПА (п. 108 КОЕ/мл) и культивируют на качалке с частотой вращения 180200 об/мин в течение 1 суток при температуре 28 С. Посевной материал, полученный в колбах,используют для засева вышеописанной питательной среды в ферментере в количестве 5 . Питательную среду готовят в ферментере и стерилизуют при 121 С в течение 30 минут. Режим культивирования в ферментере Температура культивирования 28-30 С Обороты мешалки 300-400 об/мин Расход технологического воздуха 0,6 /мин. Продолжительность культивирования 48 ч, . 12/5 - 24 ч. После окончания ферментации штаммы,выращенные отдельно, смешивают в равных соотношениях. Содержание микроорганизмов в составе препарата определяют путем высева штаммов из соответствующих разведений на поверхность плотной питательной среды МПА. Способность утилизировать керосин Т-1 устанавливают методом газовой хроматографии при росте ассоциации (засев 10) на среде ВД(Ворошилова-Дианова) с 2 керосина на качалке в течение 10 суток. Состав среды ВД (г/л) 43 1,0 2 НРО 4 - 1,0 Н 2 РО 4 - 1,0 О 4 - 0,2 СаС 2 0,02 3 - 2 капли концентрированного раствора- 10,0 твин-80 - 10,0 вода дистиллированная до 1 л. Результаты представлены в таблице 1. Таблица 1 Активность отдельных штаммов микроорганизмов и их ассоциации при росте в жидкой питательной среде восстанавливает до нитритов. Дает положительную реакцию на каталазу. Оптимальная температура роста 28-30 С. Характеризуется высокой способностью к утилизации керосина Т-1. Штамм. 20 выделен из образца почвы Комплекс Байконур пл. 31 (0-25 см). Представляет собой грамположительные спорообразующие палочки, расположенные одиночно и цепочками. Аэроб. При росте на МПА колонии округлой формы, поверхность гладкая, блестящая, края ровные. Колонии светло-бежевого цвета, диаметр 34 мм, структура однородная, консистенция маслянистая. Оптимальная температура роста 2830 С. Характеризуются высокой способностью к утилизации керосина Т-1. Штамм 18 выделен из образца почвы Комплекс Байконур пл. 196 (0-50 см). Представляет собой клетки грамположительные,неподвижные. Спор не образует аэроб. При росте на твердой питательной среде (МПА) образует мелкие, непрозрачные, беловатые, круглые, с ровным краем колонии. Рост на жидких питательных средах на мясопептонном бульоне(МПБ) образуют равномерное помутнение. Утилизирует мальтозу, сорбит, инозит, глюкозу. Сероводород и индол не образует. Дает положительную реакцию на каталазу. Оптимальная температура роста 28-30 С. Характеризуется высокой способностью к утилизации керосина Т-1. Штамм. 12/5 выделен из образца почвы Комплекс Байконур пл. 196 (0-25 см). Представляет собой клетки одиночные, круглые,иногда овальные, размер 2-4 х 3-4 мкм. Хорошо растет на агаризованной среде Раймонда (с 1 ацетата и 0,25 дрожжевого экстракта),содержащей до 8 . Ассимилирует -алканы(С 10-С 30), ацетат, пропионат. Слабое развитие на этаноле, пропаноле. Глюкозу не сбраживает. Использует аммонийный азот. Оптимальная температура роста при 28-30 С. Характеризуется высокой способностью к утилизации керосина Т-1. Установлена наибольшая активность микробного препарата при выращивании штаммов отдельно с последующим смешиванием в равных соотношениях. Препарат готовят в жидком и сублимационно высушенном виде. В жидком препарате содержится Как видно из представленной таблице, при выращивании микроорганизмов в описанной питательной среде отдельно с последующим смешиванием культур в равных соотношениях получен микробный препарат с содержанием 3 микроорганизмов 7,2108, которая утилизировала 2 керосина за 10 суток на 98,7. Пример 2. Получение сухого препарата. Получение микробного препарата проводят аналогично примеру 1. Затем биомассу микроорганизмов отделяют с помощью центрифугирования при 3000 об/мин в течение 30 мин, добавляют в нее в качестве защитного компонента 0,5 тиомочевины в соотношении 11, хорошо перемешивают и разливают в металлические лотки слоем не более 1,0 см. Лотки помещают в морозильную камеру и замораживают при температуре - 40-50 С в течение 6-8 часов. Высушивание производят в сублимационной сушилке. Температура досушивания 25 С, разряжение 45 Па. Длительность сублимационного высушивания 20-24 часа. Остаточная влажность продукта не должна превышать 10. Титр клеток в 1 г сухого препарата до 10 х 1010 КОЕ/г. Качество сухого препарата определяют аналогично примеру 1. Результаты представлены в таблице 2. Таблица 2 Показатели качества сухого препарата Как видно из представленной таблице, получены партии сухого препарата с титром 15,2 19,5 х 1010 КОЕ/г., утилизирующие керосин Т-1 через 10 суток на 97-99. Пример 3. Испытание активности жидкого препарата. Препарат готовят аналогично примеру 1. Испытания проводят в лабораторных условиях на почвах 196 пл., 31 пл. и Улытауского района,загрязненных керосином Т-1 в концентрациях 75007375 и 10250 мг/кг. Обработку почвы проводят ассоциацией с титром микроорганизмов пх 108 КОЕ/мл в дозе 2 л/га загрязненной почвы. Развитие внесенных микроорганизмов стимулируют регулярным рыхлением и увлажнением почвы раствором, следующего состава Углеводородокисляющую активность микроорганизмов устанавливали методом газовой хроматографии. Опыты по детоксикации керосина Т-1 предлагаемой ассоциацией проводят в сравнении с препаратом Деваройл при тех же условиях. При этом препарат Деваройл в соответствии с инструкцией по его применению растворяют в питьевой воде в качалочной колбе из расчета 10 г на 100 мл воды. В полученную суспензию добавляют 0,1 нефти и ставят на качалку для культивирования при 30 С в течение 24 ч. Затем суспензию разводят в соотношении 110 и используют для обработки почвы. Детоксикацию проводят в течение 3 суток при комнатной температуре. Результаты эксперимента представлены в таблице 3. Таблица 3 Утилизация различных концентраций керосина Т-1 в исследуемых почвах при комнатной температуре углеводородокисляющими микроорганизмами, входящими в состав предлагаемого микробного препарата в сравнении с препаратом Деваройл Препарат Деворойл Микробный препарат Деворойл Микробный препарат Деворойл Микробный препарат Деворойл Микробный препарат Деворойл Микробный Препарат препарат Деворойл Микробный препарат Из данных таблицы видно, что через 3 суток при использовании препарата Деваройл более полная утилизация керосина при испытанных концентрациях происходит в почве пл. 31 (86,794,0). В почве 196 пл. при исходной концентрации керосина 7500 мг/кг произошла его утилизация на 72,9, при концентрации 10437 мг/кг - на 82,0. В почве Улытауского района снижение содержания керосина при его исходной концентрации 7500 мг/кг произошло на 71,7, при 10250 мг/кг - на 76,1. При использовании предлагаемого препарата в почве пл. 31 через 3 суток во всех вариантах произошло снижение содержания керосина при тех же исходных концентрациях на 97,1-98,0. В почве пл. 196 при исходном содержании керосина 7500 мг/кг максимальное снижение его концентрации произошло на 88,3, при концентрации 10437,5 мг/кг - на 83,5. В почве Улытауского района при исходной концентрации керосина 7500 мг/кг снижение его содержания произошло на 97,3, при концентрации 10250 мг/кг - на 79,8. Таким образом, лабораторные испытания по утилизации керосина Т-1 показали более высокую способность утилизировать керосин Т-1 у предлагаемого препарата по сравнению с препаратом Деворойл. Пример 4. Испытание эффективности сухого препарата. Исследования проводят на серо-бурой почве обработанных различными концентрациями керосина Т-1. Контрольные и опытные участки имеют площадь, равную 2 м 2. Для детоксикации почв от керосина Т-1 готовят рабочий раствор из сухого микробного препарата,приготовленного аналогично примеру 3. Для этого 20 г сухого препарата с содержанием микроорганизмов 101010 КОЕ/мл растворяют в 2 л питьевой воды. Получают рабочий раствор,содержащий пх 108 клеток/мл. Перед детоксикацией на почву равномерно распределяют 7 кг минерального удобрения на 1,0 га(на 2 м 2 1,4 г). Затем почву вспахивают на глубину 20-30 см и разрыхляют. На поверхность очищаемой почвы разбрызгивают рабочий раствор препарата с помощью распылителя. Расход препарата - 2 л/м 2 с содержанием бактериальных клеток х 108 КОЕ/мл. В процессе эксперимента почву увлажняют до 60 растворенными в воде минеральными добавками, проводят ее рыхление. Количественное определение керосина Т-1 в пробах почвы проводят с применением флуориметрических методов, аттестованных в государственной системе технического регулирования Казахстана и РФ. Результаты по детоксикации серо-бурой почвы пл. 196 и песчаной почвы пл. 31, загрязненных различными концентрациями керосина Т-1,представлены в таблицах 4 и 5. Таблица 4 Использование сухого микробного препарата для детоксикации почвы пл.196, загрязненной керосином Т-1 Опыт Контроль Опыт Контроль Исходное содержание керосина мг/кг 8387,5 8387,5 26458,3 26458,3 3 суток СодержаУтилизание ция керосина керосина,мг/кг Как видно из таблицы 5, скорость детоксикации серо-бурой почвы от керосина зависит от исходной его концентрации. Так, при исходной концентрации керосина 8387,5 мг/кг почвы его утилизация произошла уже через 3 суток на 74,6, через 10 суток - на 89,0 и через 30 суток - на 97,9. При исходной концентрации керосина в 3 раза выше его утилизация через 3 суток после начала 10 суток СодержаУтилизание ция керосина керосина,мг/кг 30 суток Содержание Утилизация керосина керосина,мг/кг 172,5 97,9 958,3 88,5 1077,5 95,9 6475,0 75,5 детоксикации составляла 68,0, через 10 суток 71,3, через 30 суток - 95,9. Естественная очистка почвы от керосина при меньшей концентрации составила через 3 суток 30,4, при большей концентрации -10,8, через 10 суток - 67,4 и 41,3, через 30 суток - 88,5 и 75,5, соответственно. Таблица 5 Использование сухого микробного препарата для детоксикации почвы пл.31, загрязненной керосином Т-1 Опыт Контроль Опыт Контроль Исходное содержание керосина мг/кг 25541,7 25500,0 41791,7 44958,3 3 суток СодержаУтилизание ция керосина керосина,мг/кг Аналогичная закономерность установлена также при детоксикации песчаной почвы от керосина Т-1(таблица 5). Таким образом, сухой микробный препарат из штаммов микроорганизмов 18,. 20,25 и. 12/5 способствует более быстрой и более полной утилизации керосина Т-1 из загрязненной почвы. 10 суток СодержаУтилизание ция керосина керосина,мг/кг ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Микробный препарат для очистки почв от нефтепродуктов, в частности керосина Т-1,включающий аэробные нефтеокисляющие микроорганизмы, отличающийся тем, что в качестве аэробных углеводородокисляющих микроорганизмов содержит штаммы микроорганизмов-деструкторов 30 суток Содержание Утилизация керосина керосина,мг/кг 390,0 98,5 1250,0 95,0 3505,4 91,6 7356,3 83,6

МПК / Метки

МПК: C12N 1/00, C12R 1/00

Метки: acinetobacter, используемый, очистки, микроорганизмов-деструкторов, micrococcus, sp.20, микробный, керосином, почвы, bacillus, штаммов, загрязнения, calcoaceticum, roseus, candida, препарат

Код ссылки

<a href="http://kzpatents.com/6-ip30797-mikrobnyjj-preparat-iz-shtammov-mikroorganizmov-destruktorov-acinetobacter-calcoaceticum-18-bacillus-sp20-micrococcus-roseus-25-candida-sp-12-5-ispolzuemyjj-dlya-ochistki-pochvy-ot.html" rel="bookmark" title="База патентов Казахстана">Микробный препарат из штаммов микроорганизмов-деструкторов Acinetobacter calcoaceticum 18, Bacillus sp.20, Micrococcus roseus 25, Candida sp. 12/5, используемый для очистки почвы от загрязнения керосином Т-1</a>

Похожие патенты