Способ получения жизнеспособных растений зерновых культур и их межвидовых гибридов из эмбриокультуры незрелых зародышей

Скачать PDF файл.

Формула / Реферат

Изобретение относится к генетике, селекции и биотехнологии растений и может быть использовано при массовом получении растений видов, сортов и межвидовых гибридов пшеницы для селекционно-генетических исследований при создании новых сортов пшеницы и других зерновых культур.
Достигаемый результат - упрощение способа и повышение качества зернового мате­риала.
Указанный результат достигается тем, что в способе получения жизнеспособных расте­ний зерновых культур и их межвидовых гибридов из эмбриокультуры незрелых зародышей, включающем стерилизацию эксплантов этиловым спиртом, культивирование на питатель­ной среде в темноте до появления каллусов и побегов, а затем на свету с последующим вы­ращиванием растений регенерантов в пробирках, а затем в тепличных условиях на почве, согласно изобретению, стерилизацию эксплантов этиловым спиртом осуществляют в тече­ние 7-10 минут, культивирование на свету проводят при интенсивности освещения 5 ООО -10 ООО люкс и влажности воздуха 75 - 80 %, а из тепличных условий растения регенеранты пересаживают на почву в полевые условия и получают полноценный зерновой материал.

Текст

Смотреть все

(51) 01 4/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ селекционно-генетических исследований при создании новых сортов пшеницы и других зерновых культур. Достигаемый результат - упрощение способа и повышение качества зернового материала. Указанный результат достигается тем, что в способе получения жизнеспособных растений зерновых культур и их межвидовых гибридов из эмбриокультуры незрелых зародышей, включающем стерилизацию эксплантов этиловым спиртом,культивирование на питательной среде в темноте до появления каллусов и побегов, а затем на свету с последующим выращиванием растений регенерантов в пробирках, а затем в тепличных условиях на почве, согласно изобретению,стерилизацию эксплантов этиловым спиртом осуществляют в течение 7-10 минут,культивирование на свету проводят при интенсивности освещения 5000-10000 люкс и влажности воздуха 75-80, а из тепличных условий растения регенеранты пересаживают на почву в полевые условия и получают полноценный зерновой материал.(72) Хайленко Нина Александровна Алтаева Назира Алтайызы Искакова Ажар Батырбековна Терлецкая Нина Владимировна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт биологии и биотехнологии растений Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ РАСТЕНИЙ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР И ИХ МЕЖВИДОВЫХ ГИБРИДОВ ИЗ ЭМБРИОКУЛЬТУРЫ НЕЗРЕЛЫХ ЗАРОДЫШЕЙ(57) Изобретение относится к генетике, селекции и биотехнологии растений и может быть использовано при массовом получении растений видов, сортов и межвидовых гибридов пшеницы для Изобретение относится к генетике, селекции и биотехнологии растений и может быть использовано при массовом получении растений видов, сортов и межвидовых гибридов пшеницы для селекционно-генетических исследований при создании новых сортов пшеницы и других зерновых культур. Известен способ получения трансформированных растений зерновых культур,заключающийся в обработке эмбриогенного каллуса, незрелых или зрелых зародышей вакуумной инфильтрацией при -1,0- 0,6 атм в течение 15-60 мин в суспензиии последующей культивации эксплантов на газоне упомянутых бактерий, предварительно активизированных экссудатом табака, добавляя сначала цефатоксим в концентрации 100 -300 мг/л, а затем канамицин для отбора канамицинустойчивых растений (Патент РФ 2279211, кл. А 01 Н 4/00,2006). Недостатком данного способа является сложность реализации и необходимость использования лекарственных средств. Известен способ получения жизнеспособных растений зерновых культур из эмбриокультуры незрелых зародышей, при котором из эксплантов растений сорго получают каллусные культуры,содержащие способные к регенерации растений морфогенные образования. Для этого экспланты стерилизуют 70-ным этиловым спиртом в течение 30 - 45 секунд, затем 5 - ным хлорамином 5 минут и культивируют в темноте при 25-27 С на питательных средах,способствующих формированию морфогенных каллусов, например,Мурасиге и Скуга(МС),с 2,4 дихлорфеноксиуксусной кислотой (2,4 Д) и цитокином 6 - бензиламинопурином (6 - БАП) или на среде 6 с 2,4 Д,- аспарагиномипроли- ном . Каллусы с морфогенными структурами размножают в течение 1-3 пассажей(каждый длительностью 25-30 дней) на средах,способствующих формированию морфогенных каллусов, получая активно пролиферирующие каллусные линии с большим количеством морфогенных образований. Затем каллусы ( 1 г) на 24 часа помещают в чашки Петри с водным раствором стрептомицина (0,5-1,0 мг/мл). После обработки каллусы рассаживают на среды,способствующие формированию морфогенных каллусов, для получения достаточного количества морфогенных образований. Эти образования затем переносят на среду для регенерации растений (,1,0 мг/л ИУК 0,1 мг/л кинетина). Через 30 дней регенеранты переносят в открытые пробирки с водой для получения развитой корневой системы и затем высаживают в горшки для выращивания в теплице (заявка РФ на изобретение 95101713, кл. А 01 Н 1/06, 1996). Использование хлорамина для стерилизации эксплантов усложняет способ, кроме того хлорамин оказывает токсическое действие на растение, что снижает качество получаемого зернового материала. Задачей изобретения является получение сортов и межвидовых гибридов для селекционногенетических исследований при создании новых сортов пшеницы и других зерновых культур. Достигаемый результат - упрощение способа и повышение качества зернового материала. Указанный результат достигается тем, что в способе получения жизнеспособных растений зерновых культур и их межвидовых гибридов из эмбриокультуры незрелых зародышей, включающем стерилизацию эксплантов этиловым спиртом,культивирование на питательной среде в темноте до появления каллусов и побегов, а затем на свету с последующим выращиванием растений регенерантов в пробирках, а затем в тепличных условиях на почве, согласно изобретению,стерилизацию эксплантов этиловым спиртом осуществляют в течение 7-10 минут,культивирование на свету проводят при интенсивности освещения 5000 - 10000 люкс и влажности воздуха 75-80, а из тепличных условий растения регенеранты пересаживают на почву в полевые условия и получают полноценный зерновой материал. Скрещивания культурных форм пшеницы с дикорастущими злаками, несущими хозяйственноценные признаки, с помощью классических методов позволяют получить широкий спектр расщепления по морфологическим,цитологическим,генетическим признакам, в том числе и по признакам МС и ЦМС, начиная со второго поколения. Изобретение поясняется изображениями, где на фиг.1 представлены растения- регенеранты линии 1383103-04 5- 228, полученные из незрелых зародышей, 3 недели после посадки на среду МС на фиг.2 - растения-регенеранты линии 1322103-04 5- 68, полученные из незрелых зародышей, 3 недели после посадки на среду МС на фиг. 3 - растения-регенеранты комбинации Саратовская-29. .,полученные из незрелых зародышей, 2 недели после посадки на среду МС на фиг.4 - растениярегенеранты комбинации 1374103-04 5-210. ., полученные из каллусов и незрелых зародышей, 2 недели после посадки на среду МС на фиг.5 - растениярегенеранты видов и гибридов пшеницы, растущие в закрытом грунте на фиг.6 - колос растениярегенеранта вида . ., закрытый грунт на фиг.7 - колосья растения-регенеранта вида. . на экспериментальном участке через 2 недели после высадки в открытый грунт на фиг.8- колос растения-регенеранта из комбинации 1374. . на экспериментальном участке через 2 месяца после высадки в открытый грунт на фиг.9 - колосья сорта Саратовская-29, 2 после эмбриокультуры на фиг.10 - колосья вида .. ., 2 после эмбриокультуры на фиг. 11 - колосья растений комбинации 1374. ., 2 после эмбриокультуры. Выращивание незрелых зародышей видов,сортов и межвидовых гибридов пшеницы на искусственных питательных средах позволяет с помощью эмбриокультуры получить жизнеспособные гибридные зародыши (снять эффекты влияния чужеродного геномного состава,влияния гибридного эндосперма на рост и развитие зародыша), а также получить как можно большее количество гибридных растений с признаками мужской стерильности, для проведения генетикоселекционных анализов полученного материала, в частности, стерильных растений. Скрещивания дикорастущих и культурных форм проводили по общепринятым методам с некоторыми модификациями. Кастрировали и опыляли по 5-10 колосьев каждой комбинации. Цветки кастрировали,осторожно раздвигая цветочные чешуи, с помощью пинцета удаляя незрелые зеленые пыльники на колосьях, вышедших на 2/3 из влагалища листьев. После кастрации на колос надевали пергаментный изолятор. Опыляли с помощью твел-метода с подрезанием или без подрезания чешуй колосьев материнских сортов. Опыление проводили по мере созревания рылец в цветках, 2-3 раза, в течение 10-15 дней. Перед опылением проверяли фертильность пыльников и их способность к выбросу пыльцы, и фертильность пыльцы в цветках гибридных фертильных,гибридных полуфертильных и гибридных стерильных растений. Ниже приведены результаты получения растений видов, сортов и межвидовых гибридов пшеницы за период с 2006 г по 2012 г. Всего было изучено свыше 5000 незрелых зародышей. Способ реализуют следующим образом. 15-18 суточные, зеленные зерновки освобождают от цветковых и колосковой чешуй и обрабатывают 70 этиловым спиртом в течение 10 минут, затем промывают бидистиллированной водой 3 раза. Весь процесс стерилизации проводятся в асептических условиях в ламинарном боксе. Зародыши изолируют в стерильных чашках Петри с помощью препаравальных игл под бинокулярной лупой МС-9. Выделенные зародыши помешают щитком вверх на питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую 2 мг/л 2,4-. До появления каллусов и побегов экспланты выдерживают в термостате - в темноте при 25 С,затем переносят на свет в светокультуральную комнату, при температуре 25 С, 16-часовом фотопериоде с интенсивностью освещения 5000 10000 люкс и влажностью воздуха 75-80. Через 4 недели часть каллусов пересаживают на аналогичную свежую питательную среду, но с большей концентрацией-5 мг/л 2,4-, для поддержания роста каллусной биомассы, а другую половину каллусов - на среду МС, но с концентрацией хелата железа, уменьшенной вдвое,сахарозы 20 г/л, а вместо 2,4- - ИУК 5 мг/л, для индукции морфогенеза. Растения-регенеранты пересаживают на безгормональную питательную среду МС до появления ризогенеза. Растения-регенеранты с хорошо развитыми надземными и подземными органами вытаскивают из пробирки, очищают от агара и тщательно отмывают проточной водой, затем сажают регенерант на почву и прикрывают стеклянной посудой. Ежедневно надземную часть опрыскивают физиологическим раствором(гибберелловая кислота) и поливают по мере необходимости дистиллированной водой в течение двух недель. Когда растения-регенеранты приживутся в почве(по истечении двух недель), стеклянную посуду убирают и прекращают опрыскивание физиологическим раствором. Почву на четверть перемешивают с песком и после посадки регенеранта поверхность почвы присыпают опилками. Если развитие растений-регенерантов совпадает с весенним сезоном, двухмесячные растения можно пересадить на почву в полевых условиях. Но если пересадка растений-регенерантов на почву приходится на зимнее время, они до весны растут в тепличных условиях и только весной их переносят в полевые условия. Установлено, что каллусы из незрелых 15-ти 18-ти - суточных зародышей 5 видов и 3 сортов пшеницы в первую неделю после посадки интенсивно увеличивались в диаметре. Исключение составили растения комбинации . .Мироновская-80 - у них наблюдали торможение процесса каллусообразования по всем 6-м годам исследования. Частота каллусообразования у гибридных зародышей пшеницы была выше по сравнению с родительскими формами - она доходила до 100. Процент растений-регенерантов составил у растений разных комбинаций от 7,0 до 70,0. Процент образования каллусов у родительских форм колебался от 32,8 у . . до 100,0 у одной из линий сорта Саратовская-29, у другой же линии каллусов не было совсем, а сразу стали расти проростки из зародышей. Процент растений-регенерантов составил от 4,0 у вида. . . до 89,3 у вида .Но особенно мощными были проростки у линий из коллекции СИММИТ (фиг.1,2). Каллусы из незрелых 15-ти - 18- суточных зародышей (фиг.3, 4) комбинаций 1374103-04 5-210. ., . .1374103-04 5-210, Саратовская-29. ., . ..Саратовская-29 хорошо развивались и росли, а в некоторых случаях зародыши почти сразу же после посадки - через 1-2 недели давали ростки. Процент растений-регенерантов составил от 26,5 у комбинации . ..Саратовская-29 и до 80,6 у комбинации Саратовская-29. . Визуальные наблюдения за ростом и развитием каллусов показали, что проростки росли из точек роста самого зародыша, а не из каллусной ткани. Частота каллусообразования у родительских форм колеблется от 43,4 у . . до 73,6 у сорта Мироновская-808, а процент растений-регенерантов составил у сорта Мироновская-808 4,4, у вида . . 14,1. Растения-регенеранты сорта Саратовская 29,видов . ., . . .,. . и гибрида 1374. . на стадии кущения были пересажены в горшки с почвой. Через 3-4 месяца все растения расколосились и даже зацвели (фиг.5, 6). В апреле все растения были высажены на экспериментальном участке (фиг.7, 8). В первых числах мая они зацвели, но созревание наступило только в конце июня - в начале июля, т.е. вегетационный период очень сильно затянулся. Все пыльники были фертильными, но при сборе урожая наблюдали и полуфертильные колосья. Следующей весной зерна со всех растений были высеяны на экспериментальном участке. При фенологических наблюдениях выявлено, что растения 2 хорошо прорастали, развивались и росли - все стадии - кущение, выход в трубку,колошение были нормальными для растений ярового посева, но созревание задерживалось на 2 недели. Завязываемость зерен колебалась в пределах от 40 до 70. Также как и у растений, выращенных из контрольных семян, не прошедших стадию эмбриокультуры, стабильными были признаки высота растений, длина главного колоса,количество колосков, количество цветков в главном колосе - коэффициент вариации у них редко превышал 20. Признаки количество колосьев на одно растение и количество зерен в колосе имели высокий коэффициент вариации,достигающий 28,9 у вида . ..1374. Таким образом, и в этом случае снова подтверждается предположение о том,что наследование морфофизиологических признаков у пшеницы контролируется двумя системами генов классической и эпигенетической. На фиг.9, 10, 11 представлены колосья сорта Саратовская-29, вида . . . и растений из расщепляющихся гибридных комбинаций . .1374 и 1374. . ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения жизнеспособных растений зерновых культур и их межвидовых гибридов из эмбриокультуры незрелых зародышей, включающий стерилизацию эксплантов этиловым спиртом,культивирование на питательной среде в темноте до появления каллусов и побегов, затем на свету с последующим выращиванием растений регенерантов в пробирках, а затем в тепличных условиях на почве, отличающийся тем, что стерилизацию эксплантов этиловым спиртом осуществляют в течение 7-10 минут,культивирование на свету проводят при интенсивности освещения 5000-10000 люкс и влажности воздуха 75-80, из тепличных условий растения регенеранты пересаживают на почву в полевые условия и получают полноценный зерновой материал.

МПК / Метки

МПК: A01H 4/00

Метки: зерновых, растений, получения, гибридов, эмбриокультуры, зародышей, способ, межвидовых, жизнеспособных, культур, незрелых

Код ссылки

<a href="http://kzpatents.com/8-ip27287-sposob-polucheniya-zhiznesposobnyh-rastenijj-zernovyh-kultur-i-ih-mezhvidovyh-gibridov-iz-embriokultury-nezrelyh-zarodyshejj.html" rel="bookmark" title="База патентов Казахстана">Способ получения жизнеспособных растений зерновых культур и их межвидовых гибридов из эмбриокультуры незрелых зародышей</a>

Похожие патенты