Способ диагностики и определения предрасположенности к артериальной гипертензи в казахской этнической группе на основе использования М235Т полиморфизма гена ангиотензиногена

(51) 12 15/11 (2006.01) 01 33/50 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ ОСНОВЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ М 235 Т ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА АНГИОТЕНЗИНОГЕНА(57) Изобретение относится к области молекулярной биологии, основной сферой его применения является молекулярная генетика и медицина. Задачей предлагаемого изобретения является внедрение высокоточного, оперативного способа определения вероятности возникновения и развития АГ среди представителей казахской национальности, проживающих в РК, качественно повышающего достоверность диагноза, основанного на клинических показателях Поставленная цель достигается тем, что для анализа полиморфизма 235 ММ гена ангиотензиногена в казахской этнической группе Республики Казахстан проводится полимеразная цепная реакция (ПДРФ-вариант), направленная на выявление среди тестируемых лиц аллеля риска,связанного с заболеванием или с риском его возникновения.(72) Айтхожина Нагима Абеновна Хансеитова Александра Кабуловна Балмуханов Тимур Саимович(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Центр биологических исследований Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ В КАЗАХСКОЙ ЭТНИЧЕСКОЙ ГРУППЕ НА Изобретение относится к области молекулярной биологии, основной сферой его применения является молекулярная генетика и медицина. Изучение генов-кандидатов,являющихся маркрами сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) является перспективным направлением современной медицинской генетики, позволяющим не только повышать достоверность диагноза, основанного на традиционных показателях, но и определять риск возникновения данного заболевания до проявления клинических признаков. Артериальная гипертензия (АГ), является одной из наиболее распространенных форм ССЗ и представляет собой сложное мультифакторное полигенное заболевание, в формирование которого вносит весомый вклад генетическая составляющая. В мировой литературе опубликованы результаты исследований,показывающие различную прогностическую ценность использования М 235 Т полиморфизма А/ гена ангиотензинав различных этнических группах. В качестве прототипа можно рассматривать работу,демонстрирующую отсутствие ассоциации М 235 Т и популяциях Китая ( Т.,.,В.235/174//.- 1999.- . 33.-2.- .698- 702). Исследований, описывающих связь генетических маркеров с АГ в этнических группах Казахстана,ранее проведено не было. Недостатком приведенного способа является отсутствие данных о возможности использование 235 ММ полиморфизма гена ангиотензиногена среди населения Казахстана. Задачей предлагаемого изобретения является внедрение высокоточного, оперативного способа определения вероятности возникновения и развития АГ среди представителей казахской национальности, проживающих в РК, качественно повышающего достоверность диагноза, основанного на клинических показателях. В качестве маркров предрасположенности и риска развития АГ предлагается анализ инсерционно-делеционного полиморфизма М 235 Т генас использованием полимеразной цепной реакции. В процессе амплификации изучаемого участка образуется фрагмент размером 165 пар нуклеотидов (пн). Две замены в обратном праймере образуют сайт рестрикции для рестриктазы -,которая разрезает амплификационный продукт на два фрагмента величиной 141 пн и 24 пн в случае замены нуклеотида А нав позиции 704 гена,приводящей к аминокислотной замене метионина на треонин. Способ диагностики основан на том, что М 235 Т генотип является маркером риска развития АГ в казахской этнической группе. Задачей предлагаемого изобретения является разработка высокоточного, оперативного способа определения вероятности возникновения и развития АГ среди представителей лиц казахской национальности, проживающих в РК, качественно повышающего достоверность диагноза, основанного на клинических показателях. 2 Способ (возможность осуществления) ДНК выделяют из ядер лейкоцитов периферической крови с использованием набора производства фирмы , США. Реакционная смесь при тестировании исследуемых полиморфизмов включает в себя следующие компоненты 67 мМ Трис-НС ( 8,8) 16,6 мМ (4)24 2 мМ 2 0,01 твин-20 0,15 мг/мл альбумина по 2 пМ каждого из праймеров и смесь(, , , ) п 0,2 мМ каждого, -ДНК полимераза (1 ед/мкл) и 50 нг ДНК образца. Амплификация полиморфных фрагментов проводится следующим образом 10 циклов при 94 С - 1 мин, 68 С - 1 мин, 72 С - 1 мин, 30 циклов 94 С 30 сек 68 С - 1 мин, 72 С - 1 мин и 30 циклов 94 С 30 сек, 68 С - 1 мин, 72 С - 30 сек, финальная элонгация 72 С - 10 мин. Для тестирования М 235 Т полиморфизма изучаемого гена используются следующие последовательности олигонуклеотидных праймеров 5- СТТТСТСТТ-3 прямой и двух обратных первый для детекции А(-6) аллеля 5-ТАССААСТТ СТТССА СТ-3, второй для детекции (-6) аллеля 5 ТТС-3. Наличие мутантного варианта тестируемого аллеля в ДНК пациента служит указанием на наличие заболевания или предрасположенности к нему. Изобретение разработано в процессе тестирования образцов крови, полученных в Казахском НИИ кардиологии и внутренних болезней МЗ РК от больных АГ или лиц,страдающих другими, отличными от АГ сердечнососудистыми заболеваниями и от здоровых лиц. В качестве примера на фиг.1 приведены результаты тестирования образцов ДНК, при котором определяются аллели ММ, МТ и ТТ в исследуемом фрагменте гена , образующиеся в результате амплификации и рестрикции изучаемого полиморфного участка. На приведенной электрофореграмме образцы ДНК,демонстрирующие наличие мутантного аллеля,совпадают с установленным диагнозом, клинически подтвержденным в КазНИИ кардиологии и внутренних болезней. Фиг.1. Продукты амплификации и рестрикции фрагмента гена ангиотензаногена. Верхняя полоса - фрагмент размером 165 пн (М аллель), нижняя полоса -141 пн (образуется в результате рестрикции - Т аллель), ММ генотип 1,2, 5, 18, 24 дорожки МТ генотип 3, 6, 7, 8, 9, 11, 13,14, 16, 20, 21, 23 дорожки ТТ генотип 12, 15, 17, 19,22 дорожки. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ диагностики и определения предрасположенности к артериальной гипертензии в казахской этнической группе на основе использования М 235 Т полиморфизма гена ангиотензиногена,отличающийся тем,что верификацию диагноза осуществляют на ранних стадиях заболевания и определяют генетическую предрасположенность к возникновению заболевания до проявления клинических симптомов путем определения замены основания аденин на основание гуанин, приводящей к аминокислотной замене метионина на треонин.