Штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris SP4 для получения биомассы.

(51) 12 1/12 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(54) ШТАММ ОДНОКЛЕТОЧНОЙ ЗЕЛЕНОЙ ВОДОРОСЛИ 4 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ(57) Изобретение относится к области биотехнологии, экологии и сельского хозяйства. Заявлен штамм одноклеточной зеленой водоросли 4 для получения биомассы. Штамм депонирован в РГКП Республиканская коллекция микроорганизмов МОН РК, под номером А- 0118. Штамм одноклеточной зеленой водоросли 4 в производственных условиях культивируют с использованием питательной среды приготовленной из дешевых минеральных и органических удобрении.(72) Мусалдинов Тулеген Ботпаевич Заядан Болатхан Казыханович Жамбакин Кабыл Жапарович Акмуханова Нурзия Рахмедиева Саданов Аманкелди Курбанович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт биологии и биотехнологии растений Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан Изобретение относится к области биотехнологии,экологии, сельского хозяйства, а именно к штамму 4 для получения биомассы. Известен штамм одноклеточной зеленой водоросли, штамм ЛАРГ-3, который используется для получения биомассы зеленых микроводорослей. Недостатком штамма, штамма ЛАРГ-3 является длительный 12-и часовой световой период, что снижает его продуктивность в весенние и осенне-зимние месяцы(Ваулина Э.И. Селекция продуктивных форм водорослей. Сборник Генетические основы селекции микроорганизмов. М, Наука, 1669). Известен штамм одноклеточной зеленой водоросли 62/5 для получения биомассы,недостатком которого является резкое снижение скорости роста культуры без перемешивания и подкормки 1-м углекислым газом(СО 2). Использование баллонного углекислого газа, ее высокая стоимость, сложность транспортировки приводят к тому, что затраты при ее использовании составляет до 30 стоимости продукции. При значении рН среды ниже 7 клетки выпадают в осадок и начинают пенится. В качестве питательной среды используется среда Тамийя без бикарбоната натрия(О 3), которая необходима для поддержания фотосинтеза (А.с.237779 МПК С 12 К 1/02, опубл. 20.11.1969, бюл. 9). Задачей изобретения является получение нового штамма одноклеточной зеленой водоросли 4, предназначенного для получения и переработки биомассы. Предлагаемый штамм одноклеточной зеленой водоросли 4 отличается от известного своими морфологическими,физиологическими и культуральными признаками. Исходным для селекции штамма 4 является штамм зеленой водоросли из коллекции фототрофных микроорганизмов кафедры микробиологии Казахского Национального университета имени аль-Фараби КН МОН РК выделенного из озера Сорбулак накопителя сточной воды г.Алматы. В качестве физического мутагена для селекции использовали ультрафиолетовое излучение. Облучение штаммас плотностью 126 000 клеток проводилось в течение 5 минут при плотности потока излучения в 40 эрг/мм. После облучения выращивание клеток зеленой водорослей проводилось в чашки Петри на тврдой агаризованной среде Прата. Чашки инкубируют при температуре 28-30 С в термостате в течение 15 суток. Учет результатов работы проводят по образованию морфологически разнообразных колонии. После инкубирования в термостате из чашек отбирают колонии по фенотипическим параметрам форма, размер и цвета колоний. Установлено, что воздействия ультрафиолетового излучения приводит к уменьшению выживаемости клеток и создает возможности для оптимального образования морфологических мутаций. Так, из 126 000 клеток штаммаобразовались 14090 выживших морфологических колонов. Из этого 2 числа колоний по форме и размеру было отобрано для проведения дальнейшего исследования 12 колоний. Из 12 колоний методом многократной селекции были отобраны 6 колоний для дальнейшего исследования. Из отобранных по величине 6 колоний клонового происхождения методом группового отбора были выделены штаммы-,-4,-127,-116. Затем из этих мутантов был отобран штамм 4, который превосходит их и исходный штаммпо продуктивности,морфологическими,физиологическими и культуральными признаками. Условия хранения и поддержания штамма одноклеточной зеленой водоросли 4 в условиях коллекции на твердой среде Прата на косом агаре. Штамм одноклеточной зеленой водоросли 4 депонирован в коллекции РГКП Республиканская коллекция микроорганизмов МОН РК под номером А 0118. Характеристика штамма и морфологические признаки. Колонии предлагаемого штамма 4 на агаризованной среде Прата выглядит крупными, плотными, гладкими, овальными или круглыми, края резко очерчены, окраска темнозеленого цвета. Клетки шаровидные, одиночные,диаметром 3-10 мкм на твердой агаризованной среде Прата и 7,5-8 мкм на жидкой питательной среде 04,обладают пиреноидами, которые видны очень четко. Оболочка клеток тонкая, хроматофор широки поясковидный, автоспоры круглые, хлоропласт пристенный. Ядро часто без предварительной окраски не просматривается. Физиолого-биохимические признаки и технология культивирования. Преимущества предлагаемого штамма 4 заключается в снижении стоимости продукции, так как при выращивании клеток штамма для подержания фотосинтеза и обеспечения кислородом и углекислым газом не требуется подкормки СО 2 (против 1 СО 2) у известного штамма 62/5). Предлагаются более дешевые и доступные источники углеродного субстрата для активации интенсивности фотосинтеза. Для обеспечения углеродным субстратом активации интенсивности фотосинтеза достаточно барботирование 0,03-ой углекислотой содержащегося в атмосферном воздухе и бикарбоната натрия (О 3) содержащегося в составе среды 04. Штамм одноклеточной зеленой водоросли 4 планктонный, цикл развития короткий и простой. Половое размножение у одноклеточных зеленых водорослей, относящихся к классу не известны. Размножаются одноклеточные зеленые водоросли автоспорами,выходящими через разрыв оболочки, путем деления на 8-16 автоспор. Характеризуется высокой скоростью роста и продуктивностью. Хорошо растет в диапазоне рН от 5,5 до 7,0 ( против штамма 62/5, где при рН среды ниже 7 начинает пенится и выпадать в осадок, к тому же используется среда Тамийя без бикарбоната натрия). При непрерывном интенсивном культивировании в круглогодичном режиме изменений морфологических,физиологических и культуральных признаков не отмечен. Тип питания фото-, авто-, миксотрофный. Хорошо растет на минеральной и органо-минеральной среде. Следовательно, по типу питания предлагаемый штамм лабильный и способен переключаться с фотоавтотрофного на миксотрофный тип. Данное свойство позволяет управлять ростом и продуктивностью при массовом интенсивном культивировании 4 в производственных условиях с использованием питательной среды приготовленные из дешевых минеральных и органических удобрении. Для интенсивного выращивания предлагаемого штамма применяют различные оборудования, лабораторные фотореакторы и крупнотоннажные открытые установки реакторы с принудительным перемешиванием жидкости, без дополнительного снабжения углекислым газом. В лабораторных условиях для аэрации (О 2 и СО 2) питательной среды проводят барбатирование воздухом с использованием аквариумного насоса. В производственных условиях в крупнотонажных реакторах при интенсивном выращивании водорослей для перемешивания и аэрации воздухом используют водяной насос марки ЗК 9 с эжектором - барботаж воздухом. Отделяют клетки одноклеточных зеленых водорослей от среды сепарированием, флотацией,обычным отстаиванием и центрофугированием. Продолжительность светового периода в цикле развития 11 часов. Окраска клеток темно-зеленая,оседают на жидкой среде медленно не слипается,легко взмучиваются, не пенится. Устойчив к бактериальному, грибному заражению и спонтанному автолизу. Оптимальная температура для роста клеток в режиме культивирования 23-27 С, минимальная 1015 С, максимальная 35-40 С. Интенсивность искусственного освещения в лабораторных условиях 6 000 лк лампой дневного света ДРЛ-400, в условиях естественного (солнечного) освещения 100 000 лк,день- 12 часов, ночь-12 часов. В весенние и осеннезимние месяцы дополнительного освещения не требуется. Содержание белка в биомассе 4 изменяется в течение суток, и колеблется в пределах 45-50 на абсолютно сухой вес, пигментов хлорофилла --11 мг/г и хлорофилла - в -8,7 мг/г. Средняя фотосинтетическая продуктивность при выращивании в лабораторных условиях вес сухой биомассы составляет 5 г/(м 2, сутки) а при выращивании в открытых лотковых установках достигает 10 г сухой биомассы на 1 г/(м 2, сутки). Сведения,подтверждающие возможность осуществления изобретения. Пример. В лабораторных условиях глубинное культивирование данного штамма проводили в стеклянной колбе, объемом 5 литров, с добавлением минеральных солей (среда 04) следующего состава,г/л (4)24 - 0,2 КН 2 РО 4 - 0,077 (О 3)2- 0,1 О 3 - 0,12 О 472 О - 0,037- 0,3 3 0,003 почвенный экстракт-0,5 мл. Раствор микроэлементов - 1 мл. Состав раствора микроэлементов, г/л Н 3 Воз - 2,86 МС 24 Н 2 О - 1,81 О 472 О - 0,222 Мо 03 - 176,4 мг/10 л 4 О 3 229,6 мг/10 л О 452 О - 0,01 мг/л (О 3)242 О- 0,146- 0,083 О 42 О - 0,033 О 4(4)О 462 О-0,198. В приготовленную питательную среду 04 инокулируют маточную культуру одноклеточной зеленой водоросли 4, с плотностью 2 млн. кл/мл. Для аэрации(2 и СО 2) питательной среды проводят барбатирование воздухом с использованием аквариумного насоса. Подсчет клеток проводили через каждые 2 дней в течение 2-х недель (таблица). Таблица Динамика роста клеток штамма 4 при культивировании в лабораторных условиях,млн. кл./мл Питательная среда Дни культивирования, сутки исходное число клеток 4,0 Как видно из данных таблицы,при культивировании в лабораторных условиях на 2-е сутки плотность клеток увеличивается до 5,0 млн.кл/мл при исходной плотности 2 млн.кл/мл. Для роста микроводоросли хлореллы оптимальной является среда 04 с аммонийной формой азота. На 8 е сутки культивирования прирост число клеток составил 32,6 млн./мл,что соответствует показателям хорошо растущего штамма хлореллы. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм одноклеточной зеленой водоросли 4, депонированный в коллекции РГКП Республиканская коллекция микроорганизмов МОН РК, под номером А-0118, используемый для получения биомассы.