Штамм бактерий lactobacillus fermentum 27/ап-5, предназначенный для включения в состав микробных препаратов против желудочно-кишечных заболеваний

(51) 61 35/74 (2006.01) 12 1/20 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ быть использован в составе лечебнопрофилактических препаратов против желудочнокишечных заболеваний. Задача изобретения - получения штамма молочнокислых бактерий, устойчивого к желчи и низкому значению , обладающего высокой антимикробной активностью по отношению к возбудителям желудочно-кишечных заболеваний. Технический результат. Получен новый штамм молочнокислых бактерий 27/Ап-5, устойчивый к желчи и 3, обладающий высокой антагонистической активностью широкого спектра действия, в том числе по отношению к возбудителям желудочно-кишечной инфекции. Включение штамма в состав пробиотика позволит повысить его эффективность за счет сохранения жизнеспособности при прохождении через желудочно-кишечный тракт и высокой антимикробной активности.(76) Саданов Аманкелди Курбанович Гаврилова Нина Николаевна Ратникова Ирина Александровна Бектурганов Нуралы Султанович(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ 27/Ап-5, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ВКЛЮЧЕНИЯ В СОСТАВ МИКРОБНЫХ ПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ ЖЕЛУДОЧНОКИШЕЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ(57) Изобретение относится к микробиологической промышленности и представляет собой новый штамм молочнокислых бактерий, который может Изобретение относится к микробиологической промышленности и представляет собой новый штамм молочнокислых бактерий, который может быть использован в составе лечебнопрофилактических препаратов против желудочнокишечных заболеваний. Известны штаммы,применяемые для коррекции дисбактериозов. Наряду с другими пробиотическими микроорганизмами,этот вид отличается эффективностью в отношении урогенитальных инфекций. Так, известен штамм 904 - отобранный вариант из Лактобактерина, характеризующийся высокими адгезивными свойствами к влагалищному эпителию(Патент РФ 2133272 С 1, опубликован 20.07.1999,приоритет с 11.06.1998), однако недостатком данного штамма является узкий спектр его применения. Известен штаммМЕ-314241,используемый для приготовления лекарственного продукта для профилактики и лечения кишечных инфекций и уроинфекций, а также применяется для приготовления функциональных пищевых продуктов (Патент РФ 2003137810 А, опубликован 10.03.2005, приоритет с 11.03.1999). Недостатком штамма является отсутствие данных об его устойчивости в условиях воздействия кислот и желчи. Известен штамм 27(прототип),входящий в состав лечебнопрофилактического препарата плантафермин(Фармакопейная статья Плантафермин сухой ФС РК 42-2003 и Предварительный патент РК 21861. Ассоциации бактерий для производства препарата Плантафермин (варианты) / Гаврилова Н.Н.,Ратникова И.А., от 26.07.2007 г.) и обладающий высокой антагонистической активностью в отношении кишечной инфекции. Недостатком штамма является недостаточная устойчивость в кислой среде и в присутствии желчи, что может быть причиной снижения его эффективности при применении. Задача изобретения - получения штамма молочнокислых бактерий, устойчивого к желчи и низкому значению , обладающего высокой антимикробной активностью по отношению к возбудителям желудочно-кишечных заболеваний. Поставленная задача достигается получением нового штамма молочнокислых бактерий,27/Ап-5, устойчивого к желчи и 3,обладающего высокой антагонистической активностью широкого спектра действия, в том числе к возбудителям желудочнокишечных инфекций. Штамм 27/Ап-5 выделен из культуры 27 после инкубации ее при 3 и выращивания в питательной среде с 3 желчи. Двухсуточная культура 27/Ап-5 представляет собой грамположительные аспорогенные палочки с тупыми концами,диаметром 0,5-0,71,0-3,0 мкм, одиночные. Тип размножения - бинарное деление. При росте на твердой питательной среде образует круглые, плоские, шероховатые колонии,не пигментированные, размером 1-5 мм. При росте в жидкой питательной средепри 37 С в течение 18-24 ч происходит помутнение среды с прозрачным кольцом в верхнем слое. При этом происходит ее подкисление до 4,0. Факультативный анаэроб. Оптимальная температура роста 37 С, максимальная - 50 С,минимальная - 20 С. В качестве источника углерода использует глюкозу, глюконат, мальтозу, мелибиозу, дульцит,фруктозу, раффинозу, сахарозу. Использует органические источники азота пептон, дрожжевой автолизат или экстракт, мясной экстракт, кукурузный экстракт, экстракт солодовых ростков. Воздействия на желатин и крахмал не оказывает. 2 и индол не образует. Не обладает каталазной активностью. Не патогенен. Устойчив к желчи и низкому значению ,проявляет высокую антимикробную активность широкого спектра действия, в том числе по отношению к возбудителям кишечных инфекций. Штамм депонирован в коллекции Института микробиологии и вирусологии МОиН РК. Коллекционный номер ИМиВ В-26. Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами. Пример 1. Культуры 27 и 27/Ап-5 выращивают отдельно в течение 24 ч при 37 С в питательной среде(г/л) дрожжевой экстракт-5.0 мясной экстракт-10,0 пептон-10,0 глюкоза 20,0 лимоннокислый аммоний - 2,0 уксуснокислый натрий -5,0 твин 80-1,0 24 -2.0 КН 2 РО 4 -2,0 472 - 0,2 442 - 0,05 (рН-6,2-6,6). Затем из них отбирают по 1 мл, вносят в 10 мл стерильного физиологического раствора с 3,0 и выдерживают в термостате при 37 С в течение 30 и 60 мин. После этого пробы нейтрализуют и определяют в них количество выживших бактерий путем высева из соответствующих разведений в чашки Петри на агаризованную питательную среду. Подсчет количества выросших колоний производят на 3 сутки после термостатирования чашек при температуре 37 С. Результаты представлены в таблице 1. Таблица 1 Выживаемость молочнокислых бактерий при 3 Штаммы Содержание жизнеспособных клеток, КОЕ/мл, после инкубации в среде с 3 исходное 40 мин при 3 60 мин при рН 3 3,0109 3,2107 2,5107 9 9 8,910 2,310 1,9 х 109 Как видно из представленной таблицы, в культуре .27 после экспозиции в среде с 3 в течение 30 и 60 минут происходит снижение числа жизнеспособных клеток на 2 порядка. В этих же условиях титр бактериальных клеток в культуре. 27/п-5 изменился незначительно. Пример 2. Культуры 27 и 27/Ап-5 выращивают в питательной среде , описанной в примере 1, с добавкой 3 желчи в течение 24 часов при температуре 37 С. Затем определяют количество жизнеспособных бактерий путем высева из соответствующих разведений в чашки Петри на агаризованную среду . Подсчет количества выросших колоний производят на 3 сутки после термостатирования чашек при температуре 37 С. Результаты исследований, представленные в таблице 2, свидетельствуют, что предлагаемый штамм молочнокислых бактерий намного превосходит противопоставляемый по устойчивости к желчи. Так, если снижение титра бактериальных клеток при росте культуры .27 в питательной среде с 3 желчи произошло на 4 порядка по сравнению с исходной питательной средой, то у культуры .27/Ап-5 при тех же условиях титр бактерий был ниже на 1 порядок. Таблица 2 Рост молочнокислых бактерий в питательной средес 3 желчи Штаммы Содержание жизнеспособных клеток, КОЕ/мл исходная питательная среда с добавкой 3 желчи 3,0109 2,5105 8,6109 9,0108 Пример 3. Культуры .27 и .27/Ап-5 выращивают в питательной среде ,описанной в примере 1, в течение 24 часов при температуре 37 С. Затем определяют в них антагонистическую активность следующим образом. Чашки Петри с ровным дном помещают на горизонтальную поверхность. На водяной бане расплавляют в колбах стерильную плотную питательную среду следующего состава (г/л) бульон Хоттингера-30,0 пептон-5,0 натрий хлористый-5,0 глюкоза-10,0 агар-агар - 20,0 вода питьевая для доведения объема среды до 1 дм 3. После охлаждения до 45-50 С в агаризованную среду вносят взвесь тест-культуры из расчета 1,0 см 3 одномиллиардной взвеси на 100 см 3 среды. Содержимое колбы перемешивают и разливают в чашки Петри по 10 см 3 в каждую. В застывшей среде бором вырезают лунки,обычно по шесть. В приготовленные лунки вносят по 0,1 см 3 односуточной культуры молочнокислых бактерий. Затем чашки выдерживают около 3 ч при комнатной температуре для диффузии раствора в агар, после чего помещают в термостат при температуре 37 С на 16-18 ч. Измеряют диаметр зон подавления роста тест-культур. Для каждого образца рассчитывают среднее арифметическое значение не менее чем из трех определений. Результаты исследований представлены в таблице 3. Таблица 3. Антагонистическая активность различных штаммов молочнокислых бактерий Тест-культуры 79/10/76-9-3316. Зоны подавления роста тест-культур,мм Как видно из представленной таблицы, штамм.27/Ап-5 при росте на средепревосходит противопоставляемый штамм по величине антимикробной активности в отношении 79/1,,клинического штамма-9, ,., клинического штамма,, 5. Таким образом,предлагаемый штамм молочнокислых бактерий .27/Ап-5 превосходит противопоставляемый .27 по устойчивости к желчи и низкому значению ,что свидетельствует о лучшей его выживаемости при прохождении через желудочно-кишечный тракт. Кроме того, штамм обладает широким спектром действия и высокой антимикробной активностью, в том числе к возбудителям кишечных инфекций. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм бактерии 27/Ап-5, депонирован в коллекции ИМиВ МОН РК,под номером ИМиВ В-26, предназначенный для включения в состав микробных препаратов против желудочно-кишечных заболеваний.