Штамм бактерий lactobacillus plantarum 2в/2, предназначенный для включения в состав лечебно-профилактических препаратов против желудочно-кишечных заболеваний

(51) 12 1/20 (2006.01) 61 35/74 (2006.01) 61 1/00 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Задача изобретения - получение штамма молочнокислых бактерий, устойчивого к желчи и низкому значению , обладающего более высокой антимикробной активностью. Техническим результатом является получение нового штамма 2 в/2,устойчивого к желчи и низкому значению ,обладающий высокой антимикробной активностью в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий, в том числе возбудителей кишечных инфекций, включение которого в состав пробиотика позволит повысить его эффективность за счет сохранения жизнеспособности бактерий при прохождении через желудочно-кишечный тракт и высокой антимикробной активности.(76) Саданов Аманкелди Курбанович Гаврилова Нина Николаевна Ратникова Ирина Александровна(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ 2 в/2, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ВКЛЮЧЕНИЯ В СОСТАВ ЛЕЧЕБНОПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ(57) Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано при создании лечебно-профилактических препаратов против желудочно-кишечных заболеваний. Изобретение относится к микробиологической промышленности и представляет собой новый штамм молочнокислых бактерий, который может быть использован в составе лечебнопрофилактических препаратов против кишечных заболеваний человека и животных. Известен штамм молочнокислых бактерий 8 р-А 3 (Фармакопейная статья Лактобактерин сухой ФС-252-ВС-89),который рекомендован для лечения дисбактериозов различной этиологии у взрослых и детей. Недостатком его является преимущественно бактериостатическая антимикробная активность к возбудителям кишечных заболеваний. Имеется также прототип 2, предназначенный для использования в составе лечебно-профилактических препаратов против желудочно- кишечных заболеваний и проявляющий высокую антимикробную активность в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий, в том числе возбудителей колибактериоза,сальмонеллеза, пастереллеза, а также микобактерий(Предварительный патент РК 11843. Штамм бактерий .2, предназначенный для включения в состав лечебно-профилактических препаратов против желудочно-кишечных заболеваний/ Гаврилова Н.Н., Ратникова И.А., от 24.01.2001). Однако данный штамм имеет недостаточную устойчивость к желчи и низким значениям . Задача изобретения - получения штамма молочнокислых бактерий, устойчивого к желчи и низкому значению , обладающего более высокой антимикробной активностью. Поставленная задача достигается получением штамма молочнокислых бактерий .2 в/2,устойчивого к желчи и низкому значению ,обладающего более высокой антимикробной активностью. Штамм .2 в/2 выделен из популяции штамма .2 после трехкратной адаптации его к кислой среде (рН 3) и желчи. Двухсуточная культура .2 в/2 представляет собой грамположительные аспорогенные палочки с закругленными концами диаметром 0,6-0,80,8-2,8 мкм, одиночные, парные или в изогнутых цепочках. Тип размножения бинарное деление. При росте на твердой питательной среде образует круглые гладкие колонии с ровным краем, не пигментированные, размером 1-3 мкм. При росте в жидкой питательной средепри 37 С в течение 18-24 ч происходит помутнение среды с прозрачным кольцом в верхнем слое. При этом происходит подкисление среды до 3,8. Факультативный анаэроб. Оптимальная температура роста 37 С, максимальная - 40 С,минимальная - 10 С. В качестве источника углерода использует арабинозу, рибозу, целлобиозу, галактозу, глюкозу,глюконат,раффинозу,мальтозу,мелибиозу,сахарозу, лактозу, сорбит, дульцит, маннит,маннозу. Использует органические источники азота пептон, дрожжевой автолизат или экстракт, мясной экстракт, кукурузный экстракт, экстракт солодовых ростков. Воздействия на желатин и крахмал не оказывает. 2 и индол не образует. Не обладает каталазной активностью. Не патогенен. Устойчив к желчи и низкому значению ,проявляет высокую антимикробную активность широкого спектра действия в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий, в том числе возбудителей кишечных инфекций. Штамм депонирован в коллекции Института микробиологии и вирусологии МОиН РК. Коллекционный номерИМиВ В-30. Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами. Пример 1 Культуры .2 и .2 в/2 выращивают отдельно в течение 24 ч при 37 С в питательной среде(г/л) дрожжевой экстракт 5.0 мясной экстракт - 10,0 пептон - 10,0 глюкоза 20,0 лимоннокислый аммоний - 2,0 уксуснокислый натрий - 5,0 твин 80 - 1,0 24 - 2,0 24 2,0 472 - 0,2 442 - 0,05 ( 6,2 - 6.6). Затем из них отбирают по 1 мл, вносят в 10 мл стерильного физиологического раствора с 3,0 и выдерживают в термостате при 37 С в течение 30 и 60 мин. После этого пробы нейтрализуют и определяют в них количество выживших бактерий путем высева из соответствующих разведений в чашки Петри на агаризованную питательную среду. Подсчет количества выросших колоний производят на 3 сутки после термостатирования чашек при температуре 37 С. Результаты представлены в таблице 1. Таблица 1 Выживаемость молочнокислых бактерий при 3 Штаммы Содержание жизнеспособных клеток, КОЕ/мл исходное 40 мин при 3 60 мин при рН 3 6,0109 3,0108 2,7107 9 9 3,5 х 10 2,010 2,0 х 109 Как видно из представленной таблицы, при экспозиции в среде с 3 в течение 30 минут у культуры .2 происходит снижение числа жизнеспособных клеток на 1 порядок, а в течение 60 2 минут - на 2 порядка. В этих же условиях титр бактериальных клеток у культуры .2 в/2 практически остался без изменений. Пример 2. Культуры .2 и .2 в/2 выращивают в питательной среде , описанной в примере 1, с добавкой 3 желчи в течение 24 часов при температуре 37 С. После этого в них определяют количество жизнеспособных бактерий путем высева из соответствующих разведений в чашки Петри на агаризованную среду . Подсчет количества выросших колоний производят на 3 сутки после термостатирования чашек при температуре 37 С. Результаты исследований представлены в таблице 2, из которых видно, что предлагаемый штамм молочнокислых бактерий намного превосходит противопоставляемый по устойчивости к желчи. Таблица 2 Рост молочнокислых бактерий в питательной средес 3 желчи Штаммы Содержание жизнеспособных клеток, КОЕ/мл исходная питательная среда с добавкой 3 желчи 2,0109 1,0 х 105 9 6,5 х 10 3,0 х 109 Пример 3. Культуры .2 и .2 в/2 выращивают в питательной среде , описанной в примере 1, в течение 24 часов при температуре 37 С. После этого в них определяют антагонистическую активность следующим образом. Чашки Петри с ровным дном помещают на горизонтальную поверхность. На водяной бане расплавляют в колбах стерильную плотную питательную среду следующего состава (г/л) бульон Хоттингера - 30,0 пептон - 5,0 натрий хлористый - 5,0 глюкоза - 10,0 агар - агар - 20,0 вода питьевая для доведения объема среды до 1 дм 3. После охлаждения до 45-50 С в агаризованную среду вносят взвесь тест - культуры из расчета 1,0 см 3 одномиллиардной взвеси на 100 см 3 среды. Содержимое колбы перемешивают и разливают в чашки Петри по 10 см 3 в каждую. В застывшей среде бором вырезают лунки,обычно по шесть. В приготовленные лунки вносят по 0,1 см 3 односуточной культуры молочнокислых бактерий. Затем чашки выдерживают около 3 ч при комнатной температуре для диффузии раствора в агар, после чего помещают в термостат при температуре 37 С на 16-18 ч. Измеряют диаметр зон подавления роста тест-культур. Для каждого образца рассчитывают среднее арифметическое значение не менее чем из трех определений. Результаты представлены в таблице 3. Таблица 3 Антагонистическая активность различных штаммов молочнокислых бактерий Тест-культуры 79/10/76-9-3316.5 Зоны подавления роста тест-культур,мм Как видно из представленной таблицы, штамм .2 в/2 при росте на средепревосходит противопоставляемый штамм по величине антимикробной активности в отношении 79/1,, клинического штамма,,., 5. Таким образом,предлагаемый штамм молочнокислых бактерий .2 в/2 превосходит противопоставляемый .2 по устойчивости к желчи и низкому значению , что позволяет ему проходить через желудочнокишечный тракт без потери жизнеспособности. Кроме того, штамм обладает широким спектром действия и высокой антимикробной активностью, в том числе к возбудителям кишечных инфекций. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм бактерий 2 в/2,депонирован в коллекции микроорганизмов 3 Института микробиологии и вирусологии КН МОН РК, под номером ИМиВ В-30, предназначенный для включения в состав лечебно-профилактических