Способ диагностики инфекционного ларинготрахеита птиц методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ)

(51) 01 33/53 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННОГО ЛАРИНГОТРАХЕИТА ПТИЦ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ (ПЦР-РВ)(57) Изобретение относится к области ветеринарии,точнее - к ветеринарной вирусологии и молекулярной диагностике, и касается способа диагностики вируса инфекционного ларинготрахеита птиц. Способ осуществляется путем постановки полимеразной цепной реакции для выявления ДНК вируса инфекционного ларинготрахеита с использованием специфических праймеров и зонда. Способ позволяет обнаруживать ДНК вируса ИЛТ с довольно высокой степенью точности в короткие сроки и диагностировать данную инфекцию за 1-1,5 часа. Метод ПЦР в реальном времени позволяет обнаруживать ДНК вируса ИЛТ птиц в количестве 10-100 копий, при этом эффективность амплификации составляет 1,931. Разработанный метод ПЦР в реальном времени является специфичным и высокочувствительным при диагностике ИЛТ птиц.(72) Сандыбаев Нурлан Тамамбаевич Жолдыбаева Елена Витальевна Султанкулова Куляйсан Турлыбаевна Строчков Виталий Михайлович Зайцев Валентин Лукьянович Мамадалиев Сейдигапбар Мамадалиевич(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан 22066 Изобретение относится к области вирусологии,точнее - к ветеринарной вирусологии и молекулярной диагностике, и касается способа диагностики вируса инфекционного ларинготрахеита птиц. Известен способ -для детекции и определения количества вируса ИЛТ у домашних птиц. ПЦР продукт, образующийся в результате амплификации, составляет 103 п.о. (пар оснований). Амплификацию проводят при следующем температурно-временном режиме 50 С- 2 мин 95 С - 15 мин 94 С - 15 сек 60 С - 60 сек,повторяя цикл 40 раз. Недостатком данного способа является то, что большой размер амплифицируемого фрагмента и длительный временной режим значительно увеличивают время проведения исследований. (. . , . . , . ,. , . , . , . . , .. // . . . 139 (2007)31-38). Сущность изобретения заключается в разработке высокочувствительного и эффективного метода диагностики инфекционного ларинготрахеита (ИЛТ) птиц на основе полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Диагностика вируса инфекционного ларинготрахеита птиц высокочувствительным и специфичным методом полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени позволяет точно и очень быстро(1-1,5 часа) выявлять ДНК вируса ИЛТ у птиц с разными клиническими симптомами болезни и при смешанных инфекциях. При этом возможно одновременное исследование большого количества проб. Проведение ПЦР В работе используют следующие праймеры и зонд (Синтез специфических праймеров и зондов выполнен фирмой , Россия). 497 -565 -524 - -1 Для проведения ПЦР в реальном времени готовят реакционную смесь следующего составаобщий объем 20 мкл Вода 5,2 мкл 10 х буфер(без ионов магния) 2,0 мкл 2 (25 мМ) 4,0 мкл (4 мМ) дНТФ (10 мМ) 2,0 мкл праймер 4970,5 мкл праймер 5650,5 мкл проба 524 0,3 мкл ДНК ИЛТ 5,0 мкл-полимераза (0,5 ед) 0,5 мкл Реакцию проводят в термоциклере 2.0 фирмы . При проведении ПЦР в реальном времени используют температурно-временной режим 2 мин 95 С 00 с 95 С (денатурация) 2 03 с 55 С (отжиг) 40 циклов 05 с 72 С (синтез) Анализ результатов Автоматическая интерпретация результатов осуществляется с помощью 4.0. Определение чувствительности метода При определении чувствительности разработанного метода ПЦР в реальном времени использовали 10-кратные разведения ДНК вируса ИЛТ (штамм Отар), в концентрации от 10 нг до 0,001 нг. Используемые концентрации в нанограммах были пересчитаны в копии ДНК по формуле число копий 61023 копий/моль х концентрацияобразца / // моль,где- молекулярный вес геномной ДНК образца. Таким образом, 10 нг соответствует 106 копий ДНК вируса ИЛТ,1 нг - 105 копий ДНК вируса ИЛТ,0,1 нг - 104 копий ДНК вируса ИЛТ,0,01 - 103 копий ДНК вируса ИЛТ,0,01- 102 копий ДНК вируса ИЛТ. 1-106 копий ДНК вируса ИЛТ ,2- 105 копий ДНК вируса ИЛТ, 3- 104 копий ДНК вируса ИЛТ, 4 - 103 копий ДНК вируса ИЛТ, 5 - 102 копий ДНК вируса ИЛТ Из фиг. видно, что первый образец позволяет выявлять до 106 копий ДНК, имея значение С(Т)- до 102 копий ДНК, где С(Т)33,24. При выявлении ДНК вируса ИЛТ порядка 10 копий пороговое значение составляло С(Т)35. Таким образом, данный метод позволяет выявлять ДНК вируса ИЛТ в пределах 10-100 копий. Определение эффективности амплификации Результаты ПЦР в реальном времени с указанными выше праймерами,зондом и серийными разведениями субстрата должны иметь линейную зависимость. Степень линейности зависит от достоверности линейной аппроксимации (2). В диапазоне С(Т) 20-30 желательно, чтобы 20.99. В нашем случае 20,997. Эффективность реакции рассчитывают как Е 10-1/, гдеберется из уравнения прямой С(Т)0,полученного путем линейной аппроксимации экспериментальных данных. При Е 2 (максимально теоретически возможном значении)3.32. На практике значение Е получается несколько ниже, однако должно быть в пределах 1.7-1.8 и выше. В наших экспериментах-3,318 и Е 1,99. Определение специфичности Для определения специфичности ПЦР в реальном времени использовали матрицы нуклеиновых кислот вирусов, вызывающих схожие клинические признаки заболевания у птиц, а именно вируса болезни Ньюкасла (штамм Алатау 98), вируса оспы кур (штамм Тараз-К), а также вирусов инфекционного бронхита и гриппа птиц. В качестве положительных образцов использовали 3 22066 образца ДНК вируса ИЛТ (штаммы Отар и Майкудукский-01). 1,2- ДНК вируса ИЛТ, штамм Отар, 3 - ДНК вируса ИЛТ, штамм Майкудукский-01, 4 - ДНК вируса оспы кур, 5 - кДНК вируса инфекционного бронхита, 6 - кДНК вируса болезнь Ньюкасла, 7 кДНК вируса гриппа птиц, 8 - отрицательный контроль (вода). Из фиг. 3 видно, что во всех пробах, содержащих ДНК вируса ИЛТ птиц (пробы 1, 2 и 3) наблюдался специфический рост флуоресценции. Отрицательные результаты получены при использовании в качестве матриц кДНК вируса болезни Ньюкасла, гриппа птиц, инфекционного бронхита и ДНК оспы кур (пробы . 4, 5, 6 и 7), т. е. результаты доказывают специфичность предлагаемого метода. ПЦР продукт, образующийся в результате амплификации, составляет 68 п.о. (пар оснований), что приводит к значительному сокращению времени проведения исследований. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ диагностики инфекционного ларинготрахеита птиц методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ),включающий проведение амплификации,отличающийся тем, что для амплификации ДНКфрагмента используют специфические праймеры и зонд следующего состава 497 - ,565 - ,524- Фиг.1 Кинетические кривые ПЦР Фиг.3 Кинетические кривые ПЦР при выявлении ДНК вируса ИЛТ Верстка Болекова А.Д. Корректор Мадеева П.А.