Штамм факультативно-анаэробных ацидо- и термотолерантных целлюлолитических бактерий Bacillus coagulans 177 для биоконверсии целлюлозосодержащих отходов в кормовой продукт

(51) 12 1/20 (2006.01) 23 3/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ БИОКОНВЕРСИИ ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩИХ ОТХОДОВ В КОРМОВОЙ ПРОДУКТ(57) Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано в кормопроизводстве для микробной конверсии пшеничной и рисовой соломы, послеуборочных остатков кукурузы и подсолнечника, а также других, в том числе ранее неутилизируемых, отходов растениеводства в кормовые продукты с повышенными по сравнению с исходным сырьем показателями поедаемости,питательности и сохранности. Это достигается применением штамма целлюлолитических бактерий 177 для твердофазной ферментации целлюлозосодержащего сырья,реализуемой по типу силосования.(72) Саданов Аманкелди Курбанович Саубенова Маргарита Габбасовна Олейникова Елена Андреевна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт микробиологии и вирусологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) ШТАММ ФАКУЛЬТАТИВНОАНАЭРОБНЫХ АЦИДОИ ТЕРМОТОЛЕРАНТНЫХ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано в кормопроизводстве для микробной конверсии пшеничной и рисовой соломы, послеуборочных остатков кукурузы и подсолнечника, а также других, в том числе ранее неутилизируемых, отходов растениеводства и перерабатывающей промышленности в кормовые продукты с повышенными по сравнению с исходным сырьем показателями поедаемости,питательности и сохранности. Это достигается применением для ферментации целлюлозосодержащего сырья штамма целлюлолитических бактерийШтамм факультативно-анаэробных целлюлолитических бактерий 177,предназначенный для использования в качестве закваски при биоконверсии целлюлозосодержащих отходов растениеводства в кормовой продукт с повышенными показателями поедаемости и питательности, реализуемой по типу силосования. Штамм 177 характеризуется высокими показателями кислогои термоустойчивости. Подавляет рост гнилостных бактерий и фитопатогенных грибов из родов, ,и других. Выделен из силоса хорошего качества с последующей автоселекцией в условиях полунепрерывного культивирования на среде с карбоксиметилцел- люлозой. В известных способах силосования соломы или другого целлюлозосодержащего сырья этот процесс проводят с использованием заквасок из молочнокислых бактерий с добавлением различных питательных добавок зернофуража, концентратов,патоки, жома, молочной сыворотки, барды, ржаной муки и др. Как добавленная молочнокислая закваска, так и спонтанная микрофлора развиваются на питательных добавках и, накапливая в силосе органические кислоты, способствуют размягчению субстрата, а следовательно, лучшей его поедаемости по сравнению с сухой соломой. Однако питательная ценность силоса остается без изменения. Существует способ приготовления силоса,способствующий сохранению питательных веществ и повышению его качества, с применением двух штаммов,усиливающих ферментативные процессы и предотвращающий развитие патогенной и условно-патогенной микрофлоры (Патент 2415604, 23 3/00,опубл. 10.04.2011). В данном случае используется антагонистическая активность бациллярных штаммов, что позволяет сохранить силос от порчи посторонней микрофлорой, однако повышения питательной ценности силосуемого субстрата не происходит. Кроме того препарат требует внесения 1 раствора глюкозы для поддержания роста вносимых штаммов. Наиболее близким к заявляемому объекту является способ силосования отходов растениеводства,содержащих целлюлозу,с использованием целлюлолитического штаммаВ-4441 (предварительный патент 4028, 12 1/20, 12 9/42, 23 3/00, опубл. 2 16.12.1996), обогащающего корм протеином и биологически активными веществами. Штамм устойчив к понижениюсреды обитания при развитии спонтанной молочнокислой микрофлоры и внесенных препаратов молочнокислых бактерий. Однако степень гидролиза целлюлозы штаммомВ-4441 довольно низкая и составляет всего 3,4-3,7. Сущность изобретения Задача изобретения - получение нового штамма факультативно-анаэробных ацидои термотолерантных целлюлолитических бактерий,обладающего антибактериальной и противогрибковой активностью, с высоким уровнем гидролиза клетчатки и накопления протеина. Техническим результатом применения нового штамма факультативноанаэробных ацидо- и термотолерантных азотфиксирующих целлюлолитических бактерийавторское название 177,обладающего антибактериальной и противогрибковой активностью, является получение кормового продукта с повышенными показателями питательной ценности,переваримости и сохранности, по сравнению с кормом, полученным с использованием штамма-прототипа. Гидролизу клетчатки силосуемого сырья достигает 8,5 в зависимости от типа сырья, в корме накапливается до 4,6 протеина. В результате применения штамма поедаемость грубого целлюлозосодержащего сырья возрастает до 80-90(при поедаемости нативного субстрата 40),повышается переваримость основных кормовых компонентов рациона. Продукты метаболизма 177 стимулируют развитие молочнокислых бактерий, в результате чего накапливается больше молочной кислоты,консервирующей корм. Штамм В.177 характеризуется обильным ростом на среде без источника азота, что свидетельствует о его способности к азотфиксации. Содержание белка в силосованной с применением В.177 соломе составляет 4,61, сВ-4441 - 3,75. В.177 подавляет рост фитопатогенных грибов из родов , , , а также гнилостных бактерийса,,и других. Наличие у 177 противогрибковой активности как и в случае аналога (Патент 2415604, 23 3/00, опубл. 10.04.2011) будет способствовать повышению питательных свойств корма за счет устранения посторонней микрофлоры и повышению его сохранности даже после вскрытия силосной емкости, когда силос, приготовленный с другими заквасками, подвергается плесневению. Штамм 177, обладая способностью к фиксации молекулярного азота атмосферы и подавляя рост гнилостных и болезнетворных микроорганизмов, отличается от В.В-4441, более высокими показателями степени конверсии целлюлозы субстрата,устойчивости к более высокой температуре существования и скорости роста. При повышении температуры культивирования до 47 С штамм- прототип не растет, тогда как отселекционированный штамм В.177 сохраняет способность к росту, благодаря чему при разогревании силоса в процессе его созревания частично сохраняет свою гидролитическую активность. Штамм В.177 отличается отВ-4441 более высокой степенью гидролиза целлюлозы. Содержание клетчатки в пшеничной соломе, силосованной с применением штамма прототипа, составляет 36,60, с применением В.177 - 32,18 (в сухой соломе - 40,26),410 повышает показатели переваримости и питательности корма. Отселекционированный штамм В.177 характеризуется более высокой скоростью роста 0,650 ч-1 в оптимальных для него условиях при 3032 С (штамм прототипВ-4441 имеет максимальную скорость роста 0,449 ч-1 при оптимуме температуры 30 С), что является также неоспоримым преимуществом при наработке его биомассы в промышленных условиях. Применение нового штамма целлюлолитических бактерий в смешанной бактериальной закваске с молочнокислыми бактериями обеспечивает высокие органолептические показатели корма, стабильность и воспроизводимость процесса твердофазной ферментации, проводимой по типу силосования, при использовании любого целлюлозосодержащего сырья независимо от наличия в нем спонтанной молочнокислой микрофлоры,повышение питательности корма за счет фиксации азота атмосферы и глубокой конверсии целлюлозы субстрата даже при повышении температуры,имеющей место при созревании силоса. Штамм депонирован в РГП Республиканская коллекция микроорганизмов КН МОН РК,коллекционный номер В РКМ-0480. Непатогенен,нетоксичен. Предлагаемый штамм бактерий 177 имеет следующую морфологическую и физиолого-биохимическую характеристику. Грамположительные бактерии, относятся к температуро- и кислотоустойчивым. Представляют собой палочки с закругленными концами, размер 0,8-3,5 мкм, с возрастом по форме приближаются к коккам. Располагаются поодиночке, парами и короткими цепочками. Споры концевые. Подвижны. Факультативные анаэробы. Растут в широком диапазоне значенийсреды(3,5-10,0). Оптимум значениялежит в пределах 5,5-6,2, но хорошо развиваются и в кислой среде. Расщепляют глюкозу, арабинозу, ксилозу,сахарозу, мальтозу до кислоты. При сбраживании углеводов газы не образуют. Гидролизуют полисахариды крахмал, декстрин,целлюлозу. Синтезирует конститутивно комплекс целлюлаз, характерных для целлюлолитических бактерий. Из спиртов гидролизуют манит, дульцит нет. Протеолитические. На МПБ аммиак образуют хорошо, а индол и сероводород слабо. Желатину разжижают. Вызывают подщелочение и протеолиз молока. Казеин не гидролизуют. Ацетоин не образуют. Кагалазу образуют. Нитраты восстанавливают в нитриты. Хорошо растет на безазотистой среде Эшби,фиксируя молекулярный азот атмосферы. Рост на МПБ - тонкая пленка, среда прозрачная,осадок средний, рыхлый. Рост на МПА - поверхность мозговидная,матовая (мучнистая). Бежева- то-серого цвета. Край колоний лопастной. Структура крупнозернистая,консистенция плотная, легко снимается с агара пленкой,не слизистая. Способность эмульгироваться - взвесь в виде обрывков пленки. Растет на синтетической среде, используя в качестве источника азота минеральные соли, не требует внесения в среду готовых витаминов и факторов роста. Поддерживается на среде Гетчинсона с карбоксиметилцеллюлозой. Состав среды (г/л) К 2 НР 4 - 1,0 СаС 2 - 0,1 3 - 2,5 3 - 0,1 3 - 0,001 карбоксиметилцеллюлоза - 5,0-8,0 дрожжевой экстракт - 1,0. Штамм высевается на скошенный агар со средой Гетчинсона, выращивается в термостате при температуре 30 С в течение 24 часов и хранится в холодильнике при -1-4 С. Пересев культуры проводится 2 раза в год. Сущность изобретения подтверждается следующими конкретными примерами. Пример 1 Отселекционированный штамм 177 был использован для силосования пшеничной соломы в лабораторных условиях согласно стандартной методике. Культуру бактерий размножали в жидкой питательной среде,приготовленной из отвара соломы в течение 48 ч при температуре 28-30 С. Измельченное сырье смачивали 0,5 раствором хлорида натрия до конечной влажности 60-65, добавляли суспензию целлюлолитических бак- терий (1108 кл/мл) из расчета 10 мл суспензии на 0,7 кг сырья. В состав закваски были введены молочнокислые бактерии., используемые Институтом микробиологии и вирусологии КН МОН РК для силосования растительного сырья. Массу тщательно утрамбовывали,герметично укупоривали. Контролем служил силос, приготовленный в тех же условиях с использованием целлюлолитических бактерий В.В-4441 и молочнокислых бактерий .. После вскрытия банок с силосом (через 30 суток) были получены следующие результаты. Органолептические показатели всех образцов силоса хорошие, отмечается запах хлебной опары. Масляная кислота отсутствует. Содержание молочной кислоты в образце силоса с закваской из штамма В.177 составляет 1,1, из шт. В. 3 В-4441 - 0,9, содержание свободной уксусной кислоты соответственно 0,20 и 0,24. Структура соломы в обоих образцах силоса визуально размягчена одинаково. Данные по химическому составу соломы, силосованной с заквасками,содержащими разные штаммы целлюлолитических бактерий, в сравнении с нативной сухой соломой, приведены в таблице 1. Из данных таблицы видно, что разложение целлюлозы субстрата и содержание протеина в силосованной с применением В.1 77 соломе значительно выше по сравнению с соломой, силосованной с В.В-4441. Таблица 1 Химический состав ферментированной (силосованной) соломы с использованием в составе закваски различных целлюлолитических бактерий (вна абсолютно сухое вещество) закваска В.В-4441 В.1 77 Сухая солома Пример 2 Отселекционированный штамм В.177 использовали в качестве закваски в смешанной культуре с молочнокислыми бактериями для силосования камыша. Контролем служил силос,приготовленный в тех же условиях с закваской,состоящей из В.В-4441 и молочнокислых бактерий. Полученные данные показали,что органолептические показатели как в контроле, так и в опытном варианте хорошие. Отмечен запах хлебной опары и квашеных овощей. Масляная кислота отсутствует. Содержание молочной кислоты составляет в опыте 1,0, в контрольном варианте 1,4, уксусной - 0,22 в том и другом случае. Данные в пользу защищаемого способа получены при анализе количественного содержания(целлюлозы). Показано,что в силосе,приготовленном с введением в закваску нового штамма целлюлолитических бактерий 117, содержание целлюлозы составляет 22,0, с применением В.В-4441 - 27,5. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм факультативно-анаэробных ацидо- и термотолерантных целлюлолитических бактерий 177, депонированный в РГП Республиканская коллекция микроорганизмов КН МОН РК, под регистрационным номером В РКМ 0480,используемый для биоконверсии целлюлозосодержащих отходов в кормовой продукт.