Способ получения препарата “Бакойл-KZ” для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов

(51) 12 1/20 (2006.01) 09 1/10 (2006.01) 12 1/265 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к области биотехнологии и экологии и касается способа получения препарата Бакойл- для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов. Задача изобретения повышение нефтеокисляющей активности препарата Бакойл для очистки почв от нефти и нефтепродуктов. Техническим результатом является повышение нефтеокисляющей активности препарата Бакойл для очистки почв от нефти и нефтепродуктов за счет дополнительного введения в его состав штамма бактерийП 1.(76) Саданов Аманкелди Курбанович Гаврилова Нина Николаевна Ратникова Ирина Александровна Шорабаев Ерик Жарылкасынович(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА БАКОЙЛ- ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Изобретение относится к области биотехнологии и экологии и касается способа получения препарата нефтеокисляющих бактерий, который используется для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов. В настоящее время для очистки окружающей среды от нефтяных загрязнений используют разнообразные биопрепараты, разработанные для очистки почв от нефтяных загрязнений(коммерческие названия препаратов Авалон,Бациспецин, Валентис, Деворойл, Достроил,Нафтокс, Никаойл, Петролан, Путидойл, Родер,Универсал и др.). Самыми известными из них и давно применяющимися на практике являются биопрепараты Путидойл и Деворойл(Демьяненко А.Ф.,Мизгирев Н.С. Микробиологическая очистка грунтов от нефтепродуктов в закрытых реакторах изотермического типа // Вестник ВНИИЖТ, 2005,6). Создание высокоэффективных биопрепаратов для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов возможно лишь на основе активных углеводородокисляющих микроорганизмов и ассоциаций, адаптированных к условиям загрязнения, и разработки оригинальной технологии их производства с учетом физиологических особенностей штаммов. В Казахстане разработан бактериальный препарат с коммерческим названием Бакойл- ,созданный на основе ассоциации из адаптированных к местным условиям нефтеокисляющих бактерий 40 и 34,7 А, адсорбированных на бентоните для повышения их активности и устойчивости к неблагоприятным воздействиям. В почвах, содержащих 18 нефти,через месяц после внесения препарата утилизация нефти составила 80. Задачей изобретения является повышение нефтеокисляющей активности препарата. Поставленная зачача достигнута тем, что в состав препарата дополнительно введен штамм нефтеокисляющих бактерий .П 1. Морфологические признаки штамма при пересевах молодая культура представляет собой палочки,размножающиеся делением, неподвижные, эндоспор не образуют. Старые культуры состоят главным образом из кокковидных клеток, одиночных соединенных в пары или в виде скоплений. Размер клеток кокков 0,630,63 мкм, 0,630,77 мкм и палочек 1,250,91 мкм до 1,752,1 мкм. Колонии на мясопептонном агаре (МПА) мелкие, от точечных до 2 мм, круглые, край гладкий, поверхность гладкая, слегка блестящая, приподнятая к центру,кремоватого цвета. Окраска по Граму положительная. Физиологические признаки аэроб, максимум роста при температуре 28-34 С,среды 6,8-7,2. Желатину не разжижает, молоко с лакмусом восстанавливает,свертывания молока не наблюдается. Из углеродов ассимилирует глюкозу, маннозу,сахарозу, мальтозу, галактозу, ксилозу, арабинозу,рафинозу. Выделен из нефтезагрязненной почвы Атырауской области. Характеризуются высокой способностью к утилизации нефти и нефтепродуктов. Штамм бактерий .П 1 депонирован в коллекции Института микробиологии и вирусологии МОН РК под номером ИМиВ В-78. Препарат готовят в пастообразном и сублимационно высушенном виде. В обоих препаратах бактерии адсорбированы на бентоните для повышения их активности и устойчивости к неблагоприятным воздействиям среды. Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами. Пример 1 Культуры микроорганизмов М.40 и 34, .7, .П 1 выращивают при различных соотношениях на питательной среде следующего состава,43 - 1,0 К 2 НРО 4 - 1,0 КН 2 РО 4 - 1,0 О 4 - 0,2 СаС 2 - 0,02 3 - 2 капли концентрированного раствора,- 10,0 глюкоза - 1,0 питательный бульон - 1,0 сырая нефть 0,1 вода - остальное,среды - 6,8-7,0. Жидкую питательную среду засевают упомянутыми исходными культурами микроорганизмов (каждую отдельно) в количестве 5 смывом с косяков МПА (п.108 КОЕ/мл) и культивируют на качалке в течение 1 суток при температуре 28 С. Полученный посевной материал индивидуальных штаммов засевают в ферментационную питательную среду того же составаштаммы М.40 и .П 1 отдельно,.7-А и М.34 совместно. Культивирование проводят в аэробных условиях в течение 2 суток. После окончания ферментации культуры смешивают в разных соотношениях. Для получения ассоциации в качестве прототипа совместную культуру .7-А и М.34 смешивают с и индивидуальной культурой М.40 в соотношении 21. Для приготовления новой ассоциации совместную культуру .7-А и М.34 смешивают с и индивидуальными культурами М.40 и .П 1 в соотношении 211. Содержание бактерий в ассоциации определяют путем высева культур из соответствующих разведений на поверхность плотной питательной среды МПА. Нефтеокисляющую активность устанавливают гравиметрическим методом при росте ассоциации на среде ВД (ВорошиловаДианова) с 2 нефти на качалке в течение 10 суток. Таблица 1 Титр бактерий и нефтеокисляющая активность ассоциаций Состав ассоциации Установлено, что добавление к ассоциации,состоящей из штаммов .7-А, М.34 и М.40, нового штамма .П 1 позволяет повысить в ней содержание бактериальных клеток и нефтеокисляющую активность. Пример 2 Получение пастообразного препарата из отобранной ассоциации нефтеокисляющих бактерий. Выращивание ассоциации проводят аналогично примеру 1 Для осаждения биомассы в жидкую культуру добавляют 3 бентонита. Через 2-3,5 ч биомассу,адсорбированную на бентоните, отделяют от культуральной жидкости центрифугированием. Получают пастообразный препарат. Для определения нефтеокисляющей активности жидкие и пастообразных препараты засевают в количестве 10 в колбы Эрленмейера с питательной средой ВД,содержащей 2 нефти,а пастообразные - 2 и 5 нефти, затем ставят на качалку на 10 суток. Результаты представлены в таблице 2. Таблица 2 Нефтеокисляющая активность пастообразных препаратов Исходная концентрация Время культивирования, Утилизация нефти,нефти,суток.7-А, М.34,2 5 70,3 М.40, А.П 1 2 10 97,0 5 5 68,0 5 10 90,7 Установлено, что исходная ассоциация в пастообразном виде утилизирует за 10 суток 75,2 нефти при 5-ном содержании ее в среде, а при содержании 2 нефти - 84,0. Дополнительное введение в ассоциацию культуры .П 1 способствовало повышению нефтеокисляющей активности пастообразного препарата до 90,7 при 5 концентрации нефти в среде и до 97 - при 2 ее концентрации. Пример 3 Получение сухого препарата. Выращивание ассоциации проводят аналогично примеру 1, а получение бактериальной пасты - примеру 2. В бактериальную пасту добавляют 0,5 тиомочевины,разливают в специальные металлические лотки слоем не более 1,0 см. Лотки помещают в морозильную камеру и замораживают при температуре - 40-50 С в течение 6 часов. Высушивают в сублимационной сушилке 35. Температура досушивания продукта 25 С,разряжение 45 Па. Результаты по определению качества готовых препаратов представлены в таблице 3. Таблица 3 Показатели качества сублимационно высушенных препаратов Состав ассоциаций Титры культур, КОЕ/г до высушивания после высушивания 3,51011 Нефтеокисляющая активность сухих препаратов,85,5 Наибольшее количество жизнеспособных клеток и более высокая нефтеокисляющая активность 3 установлена в препарате, изготовленном из ассоциации, содержащей дополнительно штамм .П 1. Таким образом, дополнительное введение в состав препарата Бакойл- штамма А.П 1 повышает содержание в нем бактериальных клеток и нефтеокисляющую активность. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения бактериального препарата для очистки почв от нефти и нефтепродуктов,включающий аэробное культивирование ассоциации нефтеокисляющих бактерий 40 и 34,7, адсорбцию их на бентоните с последующим получением пастообразных или сублимационно высушенных препаратов, отличающийся тем, что в состав ассоциации дополнительно введен штаммП 1.