Рекомбинантный штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pET22/SOD, продуцирующий Cu/Zn – зависимую супероксиддисмутазу

(51) 12 15/52 (2006.01) 12 1/21 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ иммунохроматографических тест-систем на бруцеллз как ветеринарного, так и медицинского применения. Путем клонирования синтетического гена /, созданного генно-инженерными методами, в составе плазмидного вектора 22/ и трансформации данной генетической конструкцией клеток 21(3)/22/ создан штамм-продуцент рекомбинантного антигена бруцелл /-. Штамм-продуцент 21(3)/22/ при индукции изопропил 1-тиогалактопиранозидом осуществ ляет внутриклеточное накопление рекомбинантного белка . Выделение и очистка белкапроводится ультразвуковым лизисом клеточной стенки клеток рекомбинантного штамма с последующей очисткой целевого белка методами металло-аффинной хроматографии за счет наличия в белке металлсвязывающего домена. Специфичность рекомбинантного антигена/- определяли методом иммуноблотинга. В результате эксперимента установлена специфичность взаимодействия позитивной бруцеллезной сыворотки с белком молекулярной массой 20,8 , что соответствуют молекулярной массе полученного рекомбинантного антигена(72) Евтыхова Елена Борисовна Шустов Александр Вячеславович Манат Есбол Ескендирова Сауле Зиядиновна Кирибаева Асель Калиаскаровна Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(57) Изобретение относится к области генетической инженерии, медицинской и сельскохозяйственной биотехнологии. Полученный штамм-продуцент позволяет получить рекомбинантный антиген / зависимой супероксиддисмутазы , который обладает высокой диагностической ценностью для использования в разработке иммуноферментных и Изобретение относится к области генетической инженерии, медицинской и сельскохозяйственной биотехнологии. Созданный штамм-продуцент позволяет получить рекомбинантный антиген / зависимой супероксиддисмутазы , который обладает высокой диагностической ценностью для использования в разработке иммуноферментных и иммунохроматографических тест-систем на бруцеллз как ветеринарного, так и медицинского применения. С помощью рекомбинантного штамма 21(3)/22/ получена/ - зависимая супероксиддисмутаза ( КФ 1.15.1.1). Штамм-продуцент получен на основе штамма 21(3) путем его трансформации плазмидным оригинальным вектором 22/. Изобретение позволяет получить рекомбинантный аналог антигена бруцелл - / зависимой супероксиддисмутазы, выход которого составляет 8 мг из 1 литра индуцированной культуры. Бруцеллез - одно из наиболее опасных инфекционных заболеваний человека и животных выявлен на всех обитаемых континентах земли. В Казахстане заболевания людей и животных бруцеллезом зарегистрированы практически во всех регионах. В последние годы серьезное внимание уделяется возбудителю бруцеллеза как возможному эффективному средству биологического терроризма. Полигостальность бруцеллеза,полиморфизм возбудителя, хроническое, часто бессимптомное течение заболевания у человека и животных,разнообразие клинических проявлений делают его трудно диагностируемым, что в свою очередь отражается негативно на эффективности противобруцеллезных мероприятий. Учитывая сложную эпизоотическую обстановку по бруцеллезу сложившуюся в республике остро встает вопрос об обеспеченности ветеринарной службы передовыми диагностическими средствами. Одним из потенциалов повышения чувствительности и специфичности серологических тестов является использование рекомбинантных аналогов иммунодоминантных белков патогенных бруцелл, спектр которых окончательно определен и изучен в настоящее время . , К. ,Н.С. , Н. , . , Н. .1119-3//. - 2006. - . 309. - .34-47.. , С. ,.,. .//.- 2010,- . 102108.. , - ,, - , С. Об. , -.//. 2012. - .374-380. На современном этапе технология получения рекомбинантных белков 2 является основой в разработке и создании диагностических препаратов нового поколения при ряде многих инфекционных заболевании. Технология основанная на использовании генетически трансформированного штаммапродуцента,в отличие от традиционных технологий, позволяет получать высокоочищенные стабильные препараты рекомбинантных антигенов возбудителя болезни. Белковые антигены бруцелл (белки внешней мембраны (-) и цитоплазматические) широко рассматриваются зарубежными исследователями как более специфичные компоненты в создании новых вакцинных и диагностических препаратов. Впервые. (1988) изолировали и клонировали ген, кодирующий белок внешней мембраныс молекулярной массой 31 кДа (ОМР 31) и экспрессировали его в геном кишечной палочки. Нуклеотидная последовательность гена ОМР 31 была использована для разработки ПЦР-анализа . , ., ответственные за синтез пориновых белков внешней мембраны бруцелл с молекулярной массой 36 и 33 кДа, . , . , .. .36//.- 1989 .- .57. 11.- .3281-3291. В литературе описаны успешное клонирование и экспрессия в гетерологичной системе рибосомального белка 7/12 . , , . , . , . , . , .7/121//. 2010. - . 7,3. - . 132-141 и цитоплазматических белков теплового шока -и, относящихся к категории иммуногенных белков бруцелл и обладающих выраженными протективными свойствами. Периплазматический белок/(супероксиддисмутаза) является одним из главных ферментов антиоксидантной системы микроорганизмов, который рассматривается как один из универсальных механизмов патогенеза при инфекционных заболеваниях,а показатели,отражающие сдвиги в уровнях антиокислительных ферментов являются ключевыми факторами,обуславливающими прогнозирование исхода заболевания. Известно, что основным механизмом обезвреживания микроорганизмов, в том числе бруцелл при их фагоцитозе является кислородозависимый механизм. При этом фагоциты убивают поглощенные микроорганизмы разными кислородными радикалами. Нейтрализуя свободные кислородные радикалы посредством действия антиокислительных ферментов каталазы,пероксидазы,супероксиддисмутазы(СОД) микроорганизмы приобретают резистентность и адаптацию к характерному для фагоцитов окислительному стрессу, вследствие чего они выживают в очаге воспаления, а нередко и внутри фагоцитов. Персистенция микроорганизмов в организме ухудшает течение инфекционного процесса тем самым обусловливая хроническое течение бруцеллезной инфекции. Следовательно,/-СОД, находясь в периплазме бруцелл,защищает мембранные и периплазматические структуры от экзогенного воздействия супероксидов и является одним их факторов патогенности ... ..-//. - . 1994. .506-510. Курбанов А.И. Антиоксидантные ферменты микроорганизмов как потенциальные факторы патогенности, . , 51//.- 1994.- .41.- 15.-. 383-389. Исследователями определено протективное действие антиоксидантного фермента / , выраженное в значительной индукции пролиферации Т-клеток и продукции гамма-интерферона у инфицированных мышей. Так,вакцинация мышей клетками,экспрессирующего фермент /- В. ,формировала у них защиту против бруцелл. Использование с этой же целью плазмидной ДНК,включающей /- ген В. , так же индуцировало гуморальный и клеточный иммунный ответ против возбудителя бруцеллеза. Протективный эффект этой вакцины был сходен с эффектом вакцинации штаммом В.5 ., . , ., . , . ,.,В/ //. 2003.- . 71.- 9.- . 4857-4861. . , ., . , . -,. -.-48//.-2004.- . 72, . 4 2081-2087. Таким образом, периплазматический белок бруцелл /- как фактор патогенности бруцелл участвует в индукции специфического иммунного ответа вследствие высокой антифагоцитарной активности, что способствует длительной персистенции бруцелл в организме и,следовательно,является потенциально перспективным субстратом, на основе которых можно разработать эффективные препараты для диагностики и профилактики бруцеллеза. Патентный поиск среди изобретений,направленных на получение рекомбинантных супероксиддисмутаз бруцелл аналогичных работ не выявил. Отличие данного изобретения заключается в том,что супероксиддисмутаза бруцелл производится в форме рекомбинантного белка в созданном штамме. Использование плазмидного вектора 22/ позволяет получать рекомбинантный белок - -зависимую супероксиддисмутазу в качестве протективного антигена для создания препаратов иммунологической защиты против бруцеллеза. Технической задачей изобретения является создание рекомбинантного штамма 21(3)/22/, продуцирующего /зависимую супероксиддисмутазу бруцелл. Задача достигается в 3 этапа Этап 1. Создание генно-инженерной конструкции 22/ Из международной базы данныхбыли загружены последовательности гена/зависимой супероксиддисмутазы для различных видов возбудителя бруцеллеза, ,,, . Из множественного сравнения аминокислотных последовательностей /была выведена консенсусная аминокислотная последовательность антигена /-, которая использована для расчетов последовательности гена/-. Рассчитаная последовательность фрагмента ДНК длиной 496 пн, содержащего ген /- и линкеры для клонирования, показаны ниже(подчеркнуты сайтына 5-конце ина 3 конце для клонирования в экспрессирующий вектор рЕТ 22( 5-3. Продукт ПЦРраунда был использован в качестве матрицы для проведения ПЦРраунда с фланкирующими праймерами. Нараунде был получен продукт ожидаемой длины 496 пн. Полученный ПЦР-амплификат был клонирован в составе плазмиды 2(вектор для промежуточного клонирования) по фланкирующим уникальным сайтами . Плазмида 2 является производным известной плазмиды 18 и несет сайты комплементарности праймерам М 13 3(-20) (53) и М 13(53),которые были использованы для подтверждения правильности синтезированного фрагмента ДНК секвенированием. Для создания экспрессирующей конструкции для получения рекомбинантного белкаиспользовали плазмиду 22 . Фрагмент - был перенесен из плазмиды 2/ в вектор рЕТ 22, таким образом была получена генетическая конструкция 22/. Этап 2. Создание рекомбинантного штамма 21(3)/, продуцирующего/ - зависимую супероксиддисмутазу. Плазмидным вектором 22/ методом электропорации были трансформированы клетки штамма 21(3). Отбор трансформантов проводили на твердой агаризованной среде с добавлением антибиотика ампициллина. Выросшие колонии инокулировали в колбы, содержащие среду 2 с добавлением ампициллина до 100 мкг/мл. Культуры выращивали при 37 С до О 6000.8. Затем индуцировали экспрессию рекомбинантного белка добавлениемдо 0,2 мМ. После добавления индуктора температуру инкубации снижали до 28 С и продолжали культивирование, отбирая пробы(10 мл) через 4 ч., 6 ч., 8 ч. индукции и после индукции в течение ночи. Биомассу бактерий собирали центрифугированием (5000, 10 мин) и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора,следуя рекомендациям производителя прибора. Полученный лизат осветляли центрифугированием (1000, 30 мин). Осветленный лизат в дальнейшим подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Полученный штамм-продуцент 21(3)/22/ характеризуется следующими признаками Среда, температура, возраст, условия роста среда, 37 С, 120 , 16 ч. Морфологические признаки палочки 1,1-6 мкм,грамотрицательные, спор и цисты не образует,кислотонеустойчивы,подвижны за счет перитрихиальных жгутиков. Условия хранения на криосохранении при -80 С в 50 -среде и 50 глицерине, концентрация клеток 109 колониеобразующих единиц в 1 мл среды, лиофильно высушенные образцы - при температуре 4 С, -20 С, -40 С и -80 С в течение 10 лет, криоконсервированные образцы - при температуре хранения -80 С, в течение 10 лет. Культуральные признаки при росте на агаризованной средеколонии округлые, с ровными краями, консистенция мягкая, с блеском. Диаметр колоний 1 мм, цвет поверхности - светлокоричневый. Рост в жидкой среде сопровождается появлением резкого запаха, помутнением среды. Физиолого-биохимические признаки температурный оптимум для роста клеток 30 С 37 С, оптимум 7,2-7,4, тип размножения бинарное деление, агрегаты клеток - одиночные или парами. 4 Устойчивость к антибиотикам клетки проявляют устойчивость к ампициллину, обусловленную наличием в хромосомной плазмиде гена Ар. Принадлежность к трофической группе хемогетеротроф. Тип катаболизма дыхание,брожение. Отношение к кислороду факультативный анаэроб. Размер генома, наличие и характеристика плазмид Генотип - орТ(- в-)(35-71 1 7 5) . Содержит плазмиду 22 / (5940 п.н.). Дифференцирующие компоненты клеточной стенки индол, ацетилметилкарбинол (ацетоин),лимонная кислота, лактоза. Дифференцирующие антигены О- и К-антигены. Полученный штамм-продуцент 21(3)/22/ депонировали в Депозитарии ТОО Казахский научно-исследовательский институт перерабатывающей и пищевой промышленности,регистрационный номер,присвоенный коллекцией В-495. Этап 3 Выделение, очистка, определение специфичности рекомбинантного антигена /. Осветленный лизат фильтровали через нейлоновый фильтр (диаметр пор 0,45 мкм). Наибольший выход рекомбинантного белка был получен при 0,2 мМи инкубации культуры с индуктором в течение 6 часов. Было экспериментально обнаружено, что в данных условиях происходит усиленный синтез белка с молекулярной массой 20,8 кДа. Начиная с 8 ч индукции количество рекомбинантного белка в растворимой фракции убывает, что можно объяснить либо уходом рекомбинантного белка в тельца включения, либо накоплением в культуре клеток, утративших плазмиду в связи с деградацией ампициллина. Рекомбинантный белок очищали на колонке(, США) с использованием хроматографической системы . В результате получены чистые препараты рекомбинантного антигенабруцелл с молекулярной массой 20,8 кДа. Специфичность рекомбинантного антигена/- определяли методом иммуноблотинга. Перенос электрофоретически разделенных белков на нитроцеллюлозную мембрану с последующей иммунной детекцией проводили по методуР. Перенос разделенных белков из геля на лист нитроцеллюлозы ( ВА 85, размер пор 0.45 мкм, фирмы, Германия) осуществляли в камере для переноса ( 2, , Швеция), в буферном растворе следующего состава 0,048 М Трис-НС 1, 0,039 М глицин, 20 метанол, 0,1 ДСН при силе тока 1 мА на 1 см 2 в течение 1 часа. После переноса мембраны промывались раствором ФСБ в присутствии 0,1 твин-20. Избыточные сайты адсорбции на листе нитроцеллюлозы блокировали в течение 1 ч 1 раствором бычьего сывороточного альбумина в ФСБ.(сыворотка крови крупного рогатого скота или моноклональные антитела мыши) в разведении 1100 и 1500 соответственно. По окончании инкубации с первичными антителами мембрану трехкратно промывали по 10 мин в растворе ФСБ 0,1 твин-20. После отмывок мембрану инкубировали с вторичными антителами против иммуноглобулинакрупного рогатого скота или мыши соответственно,меченными пероксидазой (фирмы , титр 15000) в течение 1 ч. Затем мембрану снова трехкратно промывали в растворе ФСБ 0,1 твин-20 и визуализировали пероксидазную реакцию,используя методику усиленной хемилюминесценции . В результате эксперимента установлена специфичность взаимодействия позитивной бруцеллезной сыворотки с белком молекулярной массой 20,8 , что соответствуют молекулярной массе полученного рекомбинантного антигена/- (фиг.1). Технический результат получен рекомбинантный штамм 21(3)/22/, продуцирующий /зависимую супероксиддисмутазу. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Рекомбинантный штамм 21(3)/22/, депонирован в Депозитарии ТОО Казахский научно-исследовательский институт перерабатывающей и пищевой промышленности под регистрационным номером В-495,продуцирующий Фиг.1 Определение специфичности взаимодействия рекомбинантного антигена /- методом иммуноблотинга