Способ оценки солеустойчивости мягкой пшеницы

(51) 01 1/04 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ достигается тем,что в способе оценки солеустойчивости мягкой пшеницы, включающем проращивание семян при их увлажнении водой и раствором хлористого натрия с последующим определением содержания в надземной части растений аминокислоты пролина и выявления солеустойчивости при повышении концентрации аминокислоты в растениях, выращенных на солевом растворе,по сравнению с контрольными,выращенными на воде, согласно изобретению,дополнительно определяют содержание аминокислот в надземной части растений, а в качестве индикатора солеустойчивости используют следующие аминокислоты глицин, аланин, валин,лейцин, изолейцин, серии, треонин, глутамин,аспарагин, лизин, аргинин, цистеин, метионин фенилаланин, тирозин триптофан, гистидин, а также,суммарное процентное содержание аминокислот по группам ароматических,гетероциклических,основных,кислых и нейтральных.(72) Рысбекова Айман Бокеновна Айташева Зауре Гайнетдиновна Мамонов Леонид Кириллович Полимбетова Фатима Абулхаировна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт биологии и биотехнологии растений Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ СОЛЕУСТОЙЧИВОСТИ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ(57) Изобретение относится к области биотехнологии, физиологии и биохимии растений и может быть использовано в сельском хозяйстве, в селекции растений, растениеводстве и экологии для оценки устойчивости пшеницы к засолению. Технический результат расширение технологических возможностей способа Изобретение относится к области биотехнологии, физиологии и биохимии растений и может быть использовано в сельском хозяйстве, в селекции растений, растениеводстве и экологии для оценки устойчивости пшеницы к засолению. Известен способ определения солеустойчивости злаковых растений, включающий проращивание семян в солевом растворе. Из семян стерильно выделяют зародыши и помещают их на питательную среду, в которую дополнительно вводят 2-3 мас.хлористого натрия, при этом о солеустойчивости судят в сравнении с сортом индикатором. Зародыши культивируют на питательной среде при 28 - 30 С в течение 5 - 11 дней. В качестве сорта - индикатора используют сортообразец с максимально известной солеустойчивостью (А.с. СССР 1166745, кл. А 01 Н 1/04, 1985). Недостатком данного способа является сложность осуществления в связи с необходимостью выделения зародышей. Известен способ оценки солеустойчивости по прорастанию семян в солевых растворах. Основным показателем устойчивости является процент проросших семян за период времени от 5 до 15 суток в условиях засоления по сравнению с водным контролем(Удовенко Г.В. Диагностика устойчивости растений к стрессовым воздействиям Всесоюзный НИИ растениеводства - Л. 1988, с. 88). Использование этого способа ограничено в связи с тем, что обязательным условием его исполнения является высокая лабораторная всхожесть семян. Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ оценки солеустойчивости растений,включающий 10-суточное проращивание семян в термостате при температуре 25-28 С на увлажненной водой и 0,5-молярным раствором хлористого натрия многослойной фильтровальной бумаге, семенной материал после предварительного получасового замачивания в теплой (30-35 С) воде проращивают при круглосуточном освещении 5 тыс. лк с последующим определением содержания в листьях свободного пролина и вычислением коэффициентов солеустойчивости,которые выражаются отношением концентрации аминокислоты в растениях, выращенных на солевом растворе, к контрольной (на воде), и выделяют три группы стойкости растений высокоустойчивые к засолению (коэффициент солеустойчивости 3,0 и выше),среднеустойчивые(2,0-2,9),слабоустойчивые (1,9 и ниже) (патент РФ 2181240, кл. А 01 Н 1/04, 2002). Данный способ позволяет определить солеустойчивость только по одному показателю содержанию свободного пролина в листьях растений, что сужает его технологические возможности. Задачей изобретения является разработка усовершенствованного способа оценки солеустойчивости пшеницы. Технический результат расширение технологических возможностей способа достигается тем,что в способе оценки 2 солеустойчивости мягкой пшеницы, включающем проращивание семян при их увлажнении водой и раствором хлористого натрия с последующим определением содержания в надземной части растений аминокислоты пролина и выявления солеустойчивости при повышении концентрации аминокислоты в растениях, выращенных на солевом растворе,по сравнению с контрольными,выращенными на воде, согласно изобретению,дополнительно определяют содержание аминокислот в надземной части растений, а в качестве индикатора солеустойчивости используют следующие аминокислоты глицин, аланин, валин,лейцин, изолейцин, серии, треонин, глутамин,аспарагин, лизин, аргинин, цистеин, метионин фенилаланин, тирозин триптофан, гистидин, а также,суммарное процентное содержание аминокислот по группам ароматических,гетероциклических,основных,кислых и нейтральных. Известно, что оценка солеустойчивости растений приобретает все большее значение в селекционной,растениеводческой,интродукционной,агротехнической и экологической практике, а также в научных исследованиях по целому ряду направлений науки. Это обусловлено недостатком незаселенных земель для расширения посевов и посадок культурных растений, увеличением площадей засоленных земель за счет использования земельного фонда,необходимостью использования слабозасоленных и минерализованных вод в связи с недостатком пресной воды во многих регионах земли. При этом возникает острая необходимость в разнообразных методах объективно устанавливающих критерии и степень солеустойчивости растений в различных агроэкологических условиях. Вполне очевидно, что оценка солеустойчивости в первую очередь является ключевым параметром при отборе стресс-устойчивых растений для создания сортов, которые способны произрастать в условиях засоления. Рассмотрение изменений в составе свободных аминокислот с учетом их классификации по группам позволило выявить новые, неизвестные закономерности по выявлению засоления на изменения конкретных групп свободных аминокислот в зависимости от солеустойчивости изучаемых сортов. Эти выявленные закономерности были положены в основу предлагаемого способа оценки солеустойчивости сортов и видов пшеницы. Известно,что важнейшие аминокислоты распределяются по следующим группам алифатические глицин, аланин, валин, лейцин,изолейцин, серии, треонин, глутамин, аспарагин,лизин, аргинин, цистеин, метионин ароматические фенилаланин, тирозин гетероциклические триптофан,гистидин,пролин. Среди алифатических аминокислот выделяют кислые аминокислоты с одной группой 2 и с двумя группами СООН (аспарагин, глутамин),основные аминокислоты с двумя группами Н 2 и одной группой СООН (аргинин, орнитин, лизин) и(остальные алифатические аминокислоты). В условиях засоления происходят существенные изменения в количественном содержании разных групп свободных аминокислот,которые непосредственным образом связаны с нарушениями некоторых звеньев азотного и общего обмена и различаются у разных по солеустойчивости сортов. Особенно наглядно эти изменения происходят в надземной части растений пшеницы. Предлагаемое изобретение позволяет с высоким уровнем достоверности по изменениям в содержании групп свободных аминокислот оценить солеустойчивость сортов. У неустойчивых и слабоустойчивых сортов хотя бы в одной или нескольких группах свободных аминокислот происходит снижение общего содержания аминокислот (или хотя бы не происходит их существенного увеличения) тогда как в других группах свободных аминокислот происходит их существенное увеличение. Указанное изобретение помимо установления уровня солеустойчивости позволяет наметить пути изучения механизмов устойчивости к засолению. Пример 1. Определение свободных аминокислот проводилось у контрастных по солеустойчивости сортов мягкой яровой пшеницы (.) Казахстана - Казахстанская-126, Саратовская-29,линии Генотроф-1, Велютинум-2401, Лютесценс 19001. По истечении 2 суток половину образцов указанных сортоформ и видов переносили на среду,содержащую 1,68 . Инкубацию растений в солевом растворе продолжали в течение дальнейших 2 суток. Для определения свободных аминокислот 1 г вещества растворяли в 5 мл сульфосалициловой кислоты. После центрифугирования (1500 об/мин) в течение 5 мин надосадочную жидкость фракционировали на колонке, содержавшей в качестве сорбента ионнообменную смолу Дауэкс-50, Н-8, 200-400 меш, при скорости 1 капля в 1 сек. После этого сорбент промывался 1-2 мл деионизированной воды и 2 мл 0,5 Н уксусной кислоты. Затем сорбент отмывали деионизированной водой до нейтрального значения рН. Элюцию аминокислот с колонки производили с помощью 3 мл 6 Н раствора 4 при скорости элюции 2 капли в сек. Элюат собирали в круглодонную колбу вместе с деионизированной водой, которую использовали для отмывания колонки. Затем содержимое колбы полностью выпаривали на роторном испарителе при давлении 1 атм. и температуре 40-50 С. После добавления в ту же колбу 1 капли свежеприготовленного 1,5 раствора 12, 1 капли 2,2-диметоксипропана и 1-2 мл пропанола, насыщенного соляной кислотой, ее нагревали до 110 С, выдерживая эту температуру в течение 20 мин. Затем содержимое колбы повторно выпаривали с помощью роторного испарителя в тех же условиях. На следующем этапе в колбу вносили 1 мл свежеприготовленного ацилирующего реагента(1 объем уксусного ангидрида, 2 объема триэтиламина, 5 объемов ацетона) и нагревали при температуре 60 С в течение 1,5-2 мин. Затем образец снова выпаривали на роторном испарителе досуха и добавляли в колбу 2 мл этилацетата и 1 мл насыщенного раствора . Содержимое колбы тщательно перемешивали. По мере отчетливого образования двух слоев жидкости отбирали верхний слой (этилацетатный) для газохроматографии. Данный анализ проводили на газо-жидкостном хроматографе 4200 (Италия-США). Разделение аминокислот выполняли с помощью колонки из нержевеющей стали, размером 400 на 3 мм, заполненной полярной смесью из 0,31 карбовакса 20 м, 0,28 силара 5 СР и 0,06 лексана на хромасорбе 120-140 меш. Количественные вычисления на хроматограмме проводили с помощью внешнего стандарта фирмы(, 1974). Проведенная количественная оценка свободных аминокислот в корнях и надземных органах проростках пшеницы показала значительные их изменения по сравнению с контролем. В таблице 1 представлены данные о содержании свободных аминокислот (мг/100 г) в корнях пшеницы, в таблице 2 - данные о содержании свободных аминокислот (мг/100 г) в надземных частях пшеницы. Был проведен анализ изменений в процентном содержании свободных аминокислот по группам. В таблице 3 представлены данные об изменении содержания групп свободных аминокислот при засолении в корнях пшеницы в таблице 4 - данные об изменении содержания групп свободных аминокислот при засолении в надземной части растений. Результаты в таблицах 3 и 4 получены следующим образом суммировано общее количество свободных аминокислот по группам,затем высчитано процентное увеличение по группам аминокислот при засолении в корнях и надземных органах. Согласно проведенному анализу по изменению содержания групп свободных аминокислот в надземной части растений с высокой достоверностью можно оценивать устойчивость сортов пшеницы к засолению. У неустойчивых сортов содержание всех групп свободных аминокислот в надземной части растений при засолении уменьшалось. У устойчивых же сортов в группах аминокислот происходило существенное повышение содержания всех аминокислот при засолении по сравнению с контролем. Глицин Валии Изолейцин Лейцин Алании Серии Треонин Цистеин Метионин Аспарагиновая кислота Глутаминовая кислота Аргинин Орнитин Лизин Гистидин Глицин Валин Изолейцин Лейцин Алании Серии Треонин Цистеин Метионин Аргинин Орнитин Лизин Гистидин Таблица 3 Группы аминокислот Вариант опыта Казахстанская-126 Саратовская-29 Генотроф-1 Велютинум-2401 Лютесценс-19001 Таблица 4 Группы аминокислот Вариант опыта Казахстанская-126 Саратовская-29 Генотроф-1 Велютинум-2401 Лютесценс-19001 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ оценки солеустойчивости мягкой пшеницы, включающий проращивание семян при их увлажнении водой и раствором хлористого натрия с последующим определением содержания в надземной части растений аминокислоты пролина и выявления солеустойчивости при повышении концентрации аминокислоты в растениях,выращенных на солевом растворе, по сравнению с контрольными,выращенными на воде, отличающийся тем,что дополнительно определяют содержание аминокислот в надземной части растений, а в качестве индикатора солеустойчивости используют следующие аминокислоты глицин, аланин, валин, лейцин,изолейцин, серии, треонин, глутамин, аспарагин,лизин, аргинин, цистеин, метионин, фенилаланин,тирозин, триптофан, гистидин, а также, суммарное процентное содержание аминокислот по группам ароматических,гетероциклических,основных,кислых и нейтральных.